乳铁蛋白作为靶向功能分子的研究进展

赵超越，张云杰，姜晓艺，张颖慧，赵新辰，杨春荣Δ

（1.佳木斯大学药学院黑龙江省生物药制剂重点实验室，佳木斯黑龙江154007；2.耳鼻喉科，佳木斯大学附属第二医院，佳木斯黑龙江154002）

乳铁蛋白作为靶向功能分子的研究进展

赵超越1，张云杰1，姜晓艺2，张颖慧1，赵新辰1，杨春荣1Δ

（1.佳木斯大学药学院黑龙江省生物药制剂重点实验室，佳木斯黑龙江154007；2.耳鼻喉科，佳木斯大学附属第二医院，佳木斯黑龙江154002）

靶向功能基对载药系统主动靶向的效果起着决定性的作用。目前作为主动靶向给药系统的配体很多，如转铁蛋白、叶酸、胰岛素等，而乳铁蛋白是一种更为新型、有效的介导药物脑内递释的靶向功能分子。本文介绍了乳铁蛋白及其受体，并将其与转铁蛋白靶向功能进行比较，综述了近年来国内外学者们将乳铁蛋白作为脑内靶向功能分子的研究进展。

乳铁蛋白；转铁蛋白；受体介导；脑靶向

血脑屏障（blood-brain barrier，BBB）由脑微血管内皮细胞组成，使中枢神经系统（central nervous system，CNS）与外界隔离［1］，在调节脑内稳态保护大脑不受外界有害物质进入的同时也阻碍了化学药物对脑内疾病的治疗［2］，BBB上存在多种特异性受体，如乳铁蛋白受体、转铁蛋白受体、胰岛素受体、胰岛素样生长因子受体、乙酰胆碱受体和表皮生长因子受体等［3］，研究发现跨BBB的转运方式主要有被动扩散、吸附介导转运、载体介导转运、主动外排转运和受体介导转运等［4］，通过受体介导（receptor mediated transcytosis，RMT）转运作用递送药物入脑是目前最为成熟的脑靶向策略之一。

随着对主动靶向策略研究的不断深入，转铁蛋白家族中转铁蛋白和乳铁蛋白作为靶向功能基备受人们的青睐，转铁蛋白作为配体的文献综述屡有报道，而对于乳铁蛋白的综述却鲜见，本文将对转铁蛋白家族特别是乳铁蛋白作为脑靶向功能分子的研究进展进行综述。

1 乳铁蛋白与乳铁蛋白受体

1.1 乳铁蛋白 乳铁蛋白（lactoferrin，LF）是一种相对分子质量为80kD的球状糖蛋白［5］，由粘膜上皮细胞分泌，主要存在于哺乳动物血清中，晶体呈红色，属于非血红素类阳离子。Lf由一条多肽链构成，结构与Tf类似，折叠成两个对称的球状叶（N端和C端），Lf上共有703个氨基酸，N端包含的氨基酸序列由1～332，C端氨基酸序列由344～703，每一端都有由α-螺旋体和β-折叠片结构创建的2个区域（Ⅰ和Ⅱ）［6］，中间由一条小多肽链连接呈现 “二枚银杏叶型”结构，两端高度同源约33%～41%［7］，N端和C端上都携带一个糖基化位点和铁离子结合位点［8］，每端含有2个分支，这些分支可以可逆性的结合Fe3＋［9］，1个铁离子（Fe3＋）与Lf每一端的4个残基相连：1个天冬氨酸、1个组氨酸、2个酪氨酸［10］，形成红色的复合物［11］。Lf自身带正电荷，等电点为8.0～8.5，转铁蛋白等电点约为5.6～5.8，相对较高［12］。

而转铁蛋白（Transferrin，Tf）是一种相对分子质量为70kD的β-球蛋白，广泛分布于脊椎动物的体液及细胞中［13］，由2个高度同源的N端和C端组成的哑铃型铁离子结合糖蛋白［14］，大致分为4种：乳转铁蛋白（lactoferrin）、血清转铁蛋白（serum transferrin）、卵转铁蛋白（ovotransferrin）和黑素转铁蛋白（melanotransferrin），其中尤以乳转铁蛋白的研究最为深入，应用最为广泛。

20世纪80年代，Broxmeyer实验室首次报道了乳铁蛋白的抗病毒活性，如今许多研究已经证明乳铁蛋白具有广谱抗菌、抗病毒、抗氧化、防癌及抑制肿瘤转移、调节免疫及铁离子平衡等多种生理功能［15］。

1.2 乳铁蛋白受体 乳铁蛋白受体（lactoferrin receptor，LfR）分子量为105 kDa，为糖蛋白单体，依靠糖磷脂酰肌醇（glycosylphodphatidylinositol，GPI）连接在细胞膜表面上，主要存在于T淋巴细胞、B淋巴细胞、巨噬细胞／单核细胞和肠刷状缘细胞等几类细胞中［16］，且不同的组织和细胞表达的LfR具有不同的特点和功能。在正常的细胞中，LfR的表达量较少，在某些病理状态如帕金森症（idiopathic parkmson's disease，PD）、阿尔茨海默症（Alzheimer disease，AD）、肌萎缩性脊髓侧索硬化症患者中脑内的神经细胞和微血管中LfR表达增加［17］，通过Lf与大量未饱和的LfR的结合，有利于经Lf修饰的药物载体跨越BBB对中枢神经系统产生作用。

而转铁蛋白受体（transferrin receptor，TFR）是由2个相对分子质量为90 kD亚甲基组成，受体的外功能区因3个不同的区域组成：类蛋白酶、顶端和螺旋区域［18］。已有研究发现两种转铁蛋白受体，TFR1和TFR2都能与连接药物的Tf结合，发挥靶向作用［19］。TFR通过转铁蛋白与铁结合后凭借胞吞转运的方式进入人体脑毛细血管内皮细胞，在人体内表达数量较多［20］，是一类具有双向跨细胞功能的受体。与TFR不同，乳铁蛋白受体则是从血液循环到脑组织的单向转运。

1.3 乳铁蛋白作为靶向分子的入脑机制 脑毛细血管内皮细胞（brain capillary endothelial cells，BCECs）上存在多种特异性如低密度脂蛋白受体、转铁蛋白受体、胰岛素受体、胰岛素样生长因子受体、N-乙酰胆碱受体和表皮生长因子受体等，利用上述受体的配体或抗体为靶向功能分子构建脑靶向载药系统，可以与受体的特异性结合介导药物入脑［21］。已有大量的研究证实Lf可以携带药物跨越BBB，与靶细胞表面的受体特异性结合而发挥生理功能［22］。在加入低密度脂蛋白受体相关蛋白（low density lipoprotein receptor-related protein，LRP）的特异性拮抗剂后，抑制了70%的Lf入脑，说明了LRP参与了Lf与细胞的结合和转运，且Lf凭借胞吞作用下转运入脑［23］。LRP存在于BBB和肿瘤细胞内，可以介导Lf修饰的载药系统跨越BBB的同时与肿瘤细胞结合达到治疗的效果，并且避免了使用一些高分子聚合物而产生的不良反应［24］。

Lf具有良好的脑靶向性的原因：①饱和结合分析证实在BCECs表面和鼠脑细胞膜分别存在两极结合位点，解离常数（Kd）值分别为6～10 nmol／L、2000～5000 nmol／L［25］，由于内源性Lf的浓度约为5nmol／L，低于高结合位点的Kd值，在生理条件下，LfR不会被内源性的Lf饱和而对外源性Lf修饰的药物载体系统形成竞争性抑制；②细胞膜表面带有负电荷，Lf自身带有弱正电，2者可以自行结合以增加细胞的摄取率；③经Lf修饰的药物载体系统跨BBB转运是从血液循环到脑间隙的单向转运过程，无明显的细胞内降解，有利于系统在脑组织富集；④病理性BBB脑部神经元和微血管上存在大量未饱和的LfR，特别是多巴胺能神经元缺失严重的区域，LfR的表达更加显著，有利于经Lf修饰的药物传递系统进入脑内对中枢神经作用，达到目的；⑤经Lf修饰纳米载药系统明显降低在了心、肺、肾的聚集，表明其具有良好的脑靶向效率和组织选择性［26］。此外，Lf由于对铁具有高度的亲和性，能够螯合体内过量的铁从而减少游离铁的含量及对细胞的毒作用［27］。

2 乳铁蛋白作为脑靶向功能分子介导的新型给药系统

2.1 纳米脂质体 脂质体（lipidosome）是由磷脂分散在水相中形成的双分子层结构，纳米脂质体是指粒径在100 nm以内的脂质体，由于它在体内安全、无毒，可以对其进行适当修饰，到达特定的靶器官释放药物。李光慧等［28］制成了具有脑靶向功能的纳米脂质体载药系统，将苯甲酰胺类衍生物（125I-AIBZM）包载于该系统中，采用化学偶联的方式制成了125I-AIBZM-L和125IAIBZM-Lf-L，证实Lf介导脑靶向的功能，并且经Lf修饰的脂质体的入脑量显著高于前者。根据最新研究，选用Lf作为靶向头基，由于Lf带有正电，通过静电吸附作用修饰带有负电荷的前体阳离子脂质体（Lf-PCL），通过受体介导和吸附介导双重方式达到了脑部靶向的目的［29］。

Chen等［30］构建了乳铁蛋白载阿霉素前阳离子脂质体（DOX-Lf-PCL）用以治疗胶质瘤，采用激光扫描共聚焦显微镜和流式细胞术来评价不同DOX处方在BCECs和胶质瘤细胞C6的摄取率；并对肿瘤小鼠注射不同剂量的DOX，结果显示DOXPCLs和DOX-Lf-PCLs比DOX溶液和传统的载DOX脂质体在BCECs和C6的摄取率显著增高，在体外试验中DOX-Lf-PCLs比其它剂型更有效的限制了C6细胞的增长，且通过受体和吸附的双重介导，说明了Lf作为靶向分子的高效性。

2.2 聚合物纳米粒 聚合物纳米粒（polymer nanoparticles）是粒径在一到数百纳米之间的由聚合物材料制备的纳米粒［31］。Hu等［32］通过实验证明，经Lf修饰的PEG-PLA在体内外皆达到了很好的脑靶向效果。宋远见［33］将Lf通过PEG分别与PEGPLGA、PEG-QMC和PEG-RMC等相接枝，制备成纳米载体，提高了纳米载体携带药物穿过BBB入脑的效率。

Hu等［34］利用纳米粒表面MAL-PEG一端的马来酞亚胺基与巯基化Lf相连接，得到Lf-NPPLGA，透射电镜和ELISA试验验证Lf-NPPLGA的表面确实存在活性的Lf；并以香豆素-6作为纳米粒的荧光探针能用以较为准确的示踪其体内外的生物学行为，小鼠bEnd.3细胞摄取载香豆素-6的定性定量试验显示Lf-NPPLGA的摄取均显著高于NPPLGA，且该过程为主动转运过程。Lf-NPPLGA的摄取被过量Lf显著抑制，证实Lf-NPPLGA是由LfR转运入脑。

2.3 聚合物囊泡 聚合物囊泡（polymersome，PO）是由两亲性聚合物分子在溶液中自组装形成的双层分子结构。冯亮［35］等构建了乳铁蛋白修饰的聚合物泡囊（Lf-PO）主动靶向系统，由于LRP同时存在于BBB和肿瘤细胞上，可以介导该载药系统进入肿瘤细胞，采用小动物活体成像技术考察Lf-PO-DIR在荷瘤大鼠体内的分布，结果表明经Lf修饰的聚合物囊泡能够进入脑内并在肿瘤部位浓集，证实了Lf介导泡囊的胶质瘤靶向性，实现了载药系统对于BBB和肿瘤细胞的双靶向性。

2.4 纳米结构脂质载体 纳米结构脂质载体（nanostructured lipid carriers，NLC）作为一种新型的载药系统，由固体脂质纳米粒（solid lipid nanopartieles，SLN）发展而来，具有缓控释作用。肖衍宇等［36］通过静电吸附的作用将带正电荷的Lf与带负电荷的NLCs相连，成功的构建了具有脑靶向功能的递药系统，简化了通过共价键结合的化学修饰过程，并避免了反应过程中Lf活性的降低。

2.5 树枝状大分子 Huang等［37］评价了新型非病毒载体高分子PAMAM-PEG-Lf包载编码人源性胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）的治疗基因（hGDNF）的纳米粒在慢性PD模型大鼠上的药效，证明了经Lf修饰的NPs能够显著提高自主活性、减少多巴胺能神经元的损失，由于Lf具有穿过BBB的脑靶向能力，所以将是一种十分具有潜力的非侵袭性基因药物载体。

2.6 乳铁蛋白与转铁蛋白的入脑量比较 Lf较Tf的入脑量显著增加可能的原因有：①在正常生理状态下血浆中内源性Tf的浓度为25μmol／L，而BBB上Tf的Kd值大约为1μmol／L，生理状态下，脑内大部分Tf可能被内源性Tf占据从而降低Tf修饰的药物载体的脑靶向效率，大幅度地限制了Tf本身作为一种配体在脑靶向中的应用；②Lf跨过BBB的过程为单向转运过程，转运效率可能高于双向转运的Tf，因此入脑量显著高于Tf。Huang等［38］构建了PAMAM-PEG-Lf给药系统，在体内，乳铁蛋白修饰的PAMAM-PEG脑内摄取量是Tf修饰组的2.2倍。采用该给药系统包载质粒DNA，体内、体外的结果均显示：乳铁蛋白修饰的DNA复合物组的DNA转染效率均明显高于Tf修饰组。孙怡［39］采用了脑靶向头基Lf和Tf构建了高效的、包载IR-775的脑靶向β-环糊精衍生物纳米载体，采用异官能团双取代聚乙二醇衍生物（NHS-PEGS000-MAL）将脑靶向头基（Tf或Lf）与EDACD有效链接，尾静脉给予Tf-CD／IR及Lf-CD／IR，Lf的脑靶向效率优于Tf。

3 结语

综上所述，Lf可以介导基因、药物等构成脂质体、纳米粒等新型的药物载体，且其靶向功能、转运效率均高于Tf。本文对近年来国内外学者们对乳铁蛋白、转铁蛋白及其受体作为靶向功能分子进行了文献综述，乳铁蛋白作为一种安全、有效、新型的脑靶向功能分子已备受人们的青睐，Lf在肿瘤治疗领域中也显示了巨大的发展前景［40］，对于它的研究已经进入到了双级靶向和双重介导方式的领域，但是目前对于乳铁蛋白的研究还停留于临床前研究，还尚存在靶向效率低、组织选择性差等缺点，乳铁蛋白作为药物载体的稳定性、有效性和靶向性还应该持续探索。相信随着科研工作者的进一步研究，一定能克服以上不足，与纳米技术在更大程度上的结合，完善其在肿瘤方面的应用，使广大肿瘤患者受益。

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（编校：吴莤）

Research advances of lactoferrin as a targeted functionalmolecules

ZHAO Chao-yue1，ZHANG Yun-jie1，JIANG Xiao-yi2，ZHANG Ying-hui1，ZHAO Xin-chen1，YANG Chun-rong1Δ

（1.College of Pharmacy，Jiamusi University，The Key Laboratory of Biological Medicine Preparations of Heilongjiang Province，Jiamusi154007，China；2.Department of Otolaryngology，The Second Affiliated Hospital of Jiamusi University，Jiamusi154002，China）

Target function based on the effectof active targeting drug system plays a decisive role.Now as the active targeting drug delivery system of ligand，such as transferrin，folate and insulin，etc.Lactoferrin is a new more effective mediated drug release targeted functional molecules in the brain.This paper introduces lactoferrin and its receptors，and compared its target function with transferrin.Scholars at home and abroad in recent years was reviewed in this paper of the research progress of functionalmolecules the lactoferrin as brain targeting.

lactoferrin；transferrin；receptor-mediated；brain-targeting

R9

A

1005－1678（2014）09－0181－04

黑龙江省教育厅面上项目（12531665）；佳木斯大学研究生科技创新项目（LM2014_066）

赵超越，女，硕士在读，研究方向：脑靶向给药系统，E-mail：yue179433180＠163.com；杨春荣，通信作者，女，副教授、博士，研究方向：脑靶向给药系统，E-mail：yangchunrong98＠163.com。