微生物末端限制性片段的长度多态性研究新进展

陈尚坤

(吉林警察学院，吉林长春 130117)

微生物末端限制性片段的长度多态性研究新进展

陈尚坤

(吉林警察学院，吉林长春 130117)

有效的比对不同环境下微生物群落基因组间的差异，可为刑事侦查中鉴定不同物证的来源或异同，提供有效的分析思路;微生物基因组16S rRNA有多个区段高度保守，可以设计出通用引物，扩增所有细菌的16S rRNA片段，而16S rRNA可变区的差异则可以用来区分不同的细菌;近年来发展起来的T-RFLP(末端标记限制性片段长度多态性)技术为该策略的实施提供了新的技术平台;本文对近年来T-RFLP分析的研究进展进行了系统回顾，对其关键技术，包括引物及限制酶的选择、末端片段的解析、信号的区分以及图谱的解读等方面的最新研究方法进行了系统的比较和评价，以期为其在法庭科学中的实践提供相应的参考和帮助。

微生物群落;16S rRNA;末端限制性片段的长度多态性(T-RFLP);多样性

0 引言

在大量刑事案件中，犯罪嫌疑人为了逃避打击，往往毁灭证据，或者转移尸体等与犯罪有关的证据。犯罪嫌疑人在进出现场的过程中，鞋或者衣物会粘附有现场的泥土、水;转移尸体等物品的过程中，嫌疑人、尸体等物体粘附有现场及所经过地点的泥土、水。在一些交通肇事逃逸案件中，肇事车辆会被嫌疑人冲洗。而他们往往只注意车辆上的血迹，而不会注意所粘附的现场泥土。环境微生物学的研究说明泥土、水中分布有大量的微生物，而且呈多样性分布，不同地区及同一地区不同地点所分布的微生物种类不同，菌株也不同。大量的微生物基因组测序显示不同种类微生物的基因组序列存在差异，不同菌株的某些位置序列存在多态性。因此通过分析泥土、水中的微生物种类鉴别泥土的来源，无疑可为案件的侦破提供有力的线索和证据。

16S rRNA基因(rDNA)是最常用的作为细菌群落结构分析的系统进化标记分子。目前，人们对细菌的16S rRNA序列已有了清晰的认识:该序列全长约1 540 bp，有多个区段高度保守。根据这些保守区可以设计出细菌的通用引物，用来扩增各种细菌的16S rRNA片段，而16S rRNA可变区的差异可以用来区分不同的细菌。

随着核酸测序技术的发展，越来越多的rRNA基因序列被输入数据库。其中原核生物核糖体小亚基RNA的基因序列已达到20 000条以上。有了强大的数据库支持，采用16S rRNA作目的序列进行细菌群落结构分析就更加方便可靠。确定了合适的目的序列后，根据序列的保守区设计引物，其中一个引物的5＇端用荧光物质标记，然后提取待分析样品的总DNA，以它为模板进行PCR扩增，所得到的PCR产物一端就带有这种荧光标记。然后，将PCR产物用合适的限制性内切酶消化，由于在不同细菌的扩增片段内存在核苷酸序列的差异，酶切位点会存在差异，酶切后就产生许多不同长度的限制性片段。消化产物用DNA自动测序仪(选用Genescan功能)进行检测获得峰值图，末端带荧光标记的片段(Terminal Restriction Fragment，T-RF)或者称作操纵分类单元(Operational Taxonomic Unit，OTU)被检测到，而其他没带荧光标记的片段则检测不到。因为一种细菌的T-RF长度是唯一的，所以峰值图上的每一个峰至少代表了一种细菌。

在GeneScan的峰值图上，每个峰所占据的面积占总面积的百分数就代表了这种T-RF的相对数量。虽然不同细菌基因组上16S rRNA以不同数量的多拷贝形式存在，导致了哪种细菌对应的T-RF峰曲线下的面积大，该细菌的相对数量就大。据报道，峰值图的重复性很高，因而该技术做定量分析是非常可靠的。

更为重要的是，在法科学实验室应用T-RFLP技术进行案件的调查时，只需要比对不同样本的图谱(Profile)是否具有相同的来源，而不必去明确每个特征峰所代表的具体微生物的种类。事实上，环境中的绝大多数微生物是不可培养的，可培养的微生物只占总量的0.1%～10%，这样，应用T-RFLP技术进行法科学分析，无疑获得了比其他方法更多的信息。

1 引物的选择

理想情况下，T-RFLP分析中引物的选择应该特定于相应的目标分类群，但也需要足够通用以便于它们可扩增所有相关细菌种群。目前没有已知的引物可同时满足这两个标准。例如，通过使用探针匹配工具，在核糖体数据库项目(RDP)中一个计算机模拟的测序分析后表明，常用的细菌引物8fm(引物命名基于大肠杆菌16S rRNA基因)潜在地只能扩增76%～98%的细菌16S rRNA基因序列［1］。另外，这个分析没有考虑序列数据库只包含部分现存的细菌多样性，所以常用的引物如8fm不能完全满足实践的需要。另外，引物8fm对于细菌来说并非100%特定，因为它也匹配基因库(http:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/Gen bank/)中古细菌16S rRNA基因序列中的19个古细菌的16S rRNA基因。尽管没有完美的引物，仍然有一些基于数据库序列的工具以便研究者比较不同引物的特异性和敏感性，如在微生物群落分析(MiCA)网站(http:∥mica.ibest.uidaho.edu/)里的引物优化工具［2］及核糖体数据库项目网站(http:∥rdp.cme.msu.edu/)中的探针匹配工具［1］。不足之处在于目前尚无可以同时分析古细菌序列的工具。

如果仅使用一个荧光标记引物进行检测，可能造成在一个样本中低估微生物多样性的结果。因为不同的菌群可由一个特定的引物酶切组合而产生相等的末端限制长度片段［1］。如果使用两个标记引物可以削弱这个问题，前提是那些不可能被一个引物所区分的种群可以通过第二个标记引物产生的末端片段所提供的额外信息加以区分［3］。通过引入第三个或更多标记引物可以更进一步解决这一问题。例如，Zhou［4］应用两个独立的PCR反应以扩增人类阴道菌群的16S rRNA基因，这两个PCR反应采用两个不同标记的正向引物结合相同的反向引物。消化后，两个反应的限制产物在分析前进行混合，分析取得了良好的效果。

相同的PCR反应中也可以使用多个引物以研究总群落中不同的类群(复合扩增)。如Singh［5］等针对细菌、古细菌和真菌，使用了3对不同的引物对土壤的生物群进行了复合扩增，并应用3个独立的PCR反应及其产生的T-RFLP图谱，对此复合扩增及其酶切的效能进行了评估，另外，他们还应用单个PCR反应的产物构建DNA池进行了对比分析。结果显示，单个反应、复合扩增及PCR产物池的图谱，在代表样本中不同微生物的峰的数目、位置及相对峰值等指标上是一致的。

2 限制酶的选择

T-RFLP分析区分细菌种群的方法，依赖于使用限制性内切酶来检测16S rRNA基因的序列多态性。通常情况下，那些有四个碱基对识别位点的酶，由于具有较高的识别频率而被使用。一些研究已经证明，使用一个以上的限制性内切酶提高了细菌种群的分辨率。这是因为，不同的细菌种群经一个特定引物-酶组合处理后，可产生相同的末端限制性长度片段［1］。

检测不同的限制性内切酶对于特定序列的消化能力，可通过基因序列数据库、不同富度种群以及从T-RFs数据库反复随机抽样等方法。Engebretson与Moyer［6］评估了18种限制酶后发现，在他们的模型群落中最常用于剪切单个群落的酶是BstUI，DdeI，Sau961和MspI。对于超过50个操作分类单元(OTUs)的群落，没有一种限制酶可以作用于OTUs总量的70%以上。因此，T-RFLP能够有效地用于低或中等丰富度的群落。

评价一种限制性内切酶对不同序列的消化能力可借助生物信息学工具来完成，比如T-RFLP分析程序(TAP)TRFLP(http:∥rdp8.cme.msu.edu/html/TAP-trflp.html)、针对16S rRNA基因的MiCA (http:∥mica.ibest.uidaho.edu/)工具以及目的在于功能基因的ARB实现工具TRF-CUT(http:∥www.mpi-marburg.mpg.de/downloads/)等。TAP TRFLP位于RDP网站，它通过运用数据库数据来进行计算机模拟，以不同的引物-酶组合来消化数据库中所有的16S rRNA基因，从而进行限制酶的选择。TAP T-RFLP把选择的一个正向或反向引物相匹配于数据库中的每一个序列后，将所有匹配引物的序列都通过已选择的选择限制酶进行计算机模拟消化。这样的分析可以解决几个问题:①哪种(些)酶最适用于区分种系从而进行种群多样性评估;②哪种(些)酶最适用于识别靶系统基因组;③哪种(些)引物-酶组合最适合一个特定的数据集。默认的输出结果显示在RDP的系统层次结构中。此外，这些结果可以通过序列名称或末端片段大小进行整理。虽然TAP TRFLP是一个功能强大的工具，对不同的限制性内切酶对各种群的分辨能力，可以给研究者以直观的印象，但也同时具有特殊限制。它只允许一个引物酶组合被指定，数据不能自动排序，并且结果不能被打印或输出于其他程序。相反，MiCA允许用户指定正向引物与反向引物，一个引物与目标序列的不匹配数量，可选择3个限制酶且可选择使用数据库。该工具使用连接到数据库的一个查询程序，并在特定参数的基础上对数据进行分析。结果可被写入PHP、纯文本或逗号分隔值格式。然而，这些结果的缺陷是它们可能会非常大且难以解释。另外一个可选择的的工具是限制性内切酶选择器(REPK;http:∥rocaplab.ocean.washington.edu/ tools/repk)，该程序可针对用户指定的序列，自动确定相关的的限制酶集。用户输入一个修整后的FASTA格式文件，文件包含被用于计算机模拟消化分析的序列。上传FASTA文件后，可通过最新REBASE数据库得出的列表中来选择限制酶，或者用户自行定义来选择。比如末端片段的最小、最大允许长度和每种酶必须能够区分的种群数目的最小阈值等，诸如此类的指标都可具体设置。所有选定的限制酶都双向消化既定序列。末端片段的大小被确定并且产生一个模型。特定大小的酶切片段被置于特定“箱体”中并认为大小相同。然后，程序会决定“箱体”内是含有单一细菌种群的序列还是不同种群的序列，不同种群序列意味着该特定的限制酶不能区分细菌种群。那些能够充分区分细菌种群的酶经过严格筛查并被保存在最终输出结果中。Collins与Rocap［7］研究表明，如果一个新的群落必须被区分，或者一个既定群落的组成成分必须被区分，那么REPK将会特别适用。

尽管网络工具和计算机模拟实验研究提供了判断限制酶分辨细菌群落的能力，这些工具产生的结果仍需谨慎使用。研究人员必须谨记，目前发现的细菌多样性只是一小部分而且序列数据库是不完整的。因此，样品中含有的种系，没有在任何数据库中表示出来的情况是可能的。因此，计算机模拟消化分析选择引物-酶组合时应根据经验评估以确保这些酶能够更好地区分样品种群。

3 末端片段的解析

样品中荧光标记T-RFs的长度与丰度的差别通常使用毛细管或聚丙烯酰胺凝胶电泳区分，T-RFs的电泳迁移率与已知标准大小比较。T-RFs的实际大小通过插值算法估计，如Local Southern算法可用于GeneScan和GeneMapper这样的软件包。每个TRF的丰度由荧光强度来确定并表示为峰高或峰面积。一般来说，T-RFLP分析采用毛细管电泳会比聚丙烯酰胺凝胶电泳更精确且重现性更好［8］。即便如此，运行间的变化造成即使是相同的细菌种群的末端片段都会存在细小偏差，因此图谱识别需要保持一致。不同大小的片段一般被分配至不同种类的操作分类单元或“箱”中。每个“箱”中可能实际包含不止一个种系，这由被分析群落的物种复杂性、种群间的亲缘关联度以及引物与酶的剪切能力所决定。毛细管系统的一个缺点是，由于采用电动进样，通过施加电场将带电分子注入到毛细管中，这会导致越小的分子越先进入，所以应将盐和PCR反应［9］或酶切反应［10］的引物在样品分析前去除。

片段大小的精确确定尤为重要，特别是在如果我们的目的是从T-RFLP图谱推断出合理的群落组成的前提下。使用网络工具可确定合理的群落组成，其中，T-RFs的大小应与来自数据库信息中相应种群的16S rRNA基因的T-RF大小相匹配。然而有时这点并不能保证做到，因为假的T-RFs(特别是单链扩增子)可能在PCR反应中形成［11］，并且不同的荧光团可以通过不同方式影响片段的电泳迁移率，使在确定片段大小时产生错误［12］。尽管DNA片段的毛细管电泳分析是非常精确的(±1 bp)，但它并不一定是准确的，因为尚存在一些不确定因素。用荧光素染料标记的DNA片段，例如6FAM和HEX，迁移速率比那些用罗丹明染料标记的DNA片段(如ROX)快得多，后者常用于作为系统内标。其结果是，HEX或6FAM标记的末端片段大小会被低估。调整迁移行为的差异是不容易的，因为片段大小差异的幅度不是恒定的。对于小于100 bp的片段，其差别可达11 bp［13］，对于大约500 bp的片段，其差别又会减少至2～3 bp，而对于大于700 bp的片段，这种差值又会增加。另外，各片段中嘌呤含量的不同也可带来T-RF真实值和观察值大小的差异［14］。此外，用于确定DNA片段大小的算法的性能也随着DNA片段大小的增加而降低。常用的Local Southern算法假定片段的迁移时间随着片段大小线性增加，但事实并非如此，所以越大的DNA片段就越可能被错误认定。目前，没有任何的解决方案可以纠正由于使用不同荧光造成的迁移差异，研究者在使用T-RFLP数据以确定群落组成时应该考虑到这一点。

4 从干扰中区分信号

T-RFLP图谱分析的第一步是将信号从电子干扰中区分出来，即需要确定基准线。GeneScan和GeneMapper这样的程序可以确定峰的开始与结束、峰的高度及面积等，但必须由研究者确定实际基准。因为不同的运行过程产生不同的电子干扰，所以理想情况下，用来从图谱的干扰信号中筛查真实信号的程序应该是一个自动化的客观方法。峰高或者峰面积都可以用来从干扰中区分信号，且两者具有各自的优点和缺点［15］。确定基线的方法目前包括固定阈值、比例阈值以及统计确定阈值等几种。

区分信号最简单的方法是施加一个固定的检测阈值，即随机选择的值，如50或100 FU(荧光单位)。采用高检测阈值，如100 FU［16］，可确保将峰误判为干扰的数目大大减少，但风险在于可能将客观存在的矮小峰排除在外。此外，设定固定的检测阈值的前提，是基于检测样本的图谱是不受负荷与检测效率等实验误差影响的假设。Dunbar［17］已经表明阈值不能被任意预先设定，因为最佳阈值在样本间存在差异。基于此，固定阈值的方法不是一个有效的方法。

一个更精确的方法是使用一个固定的百分比阈值［18］。要做到这一点，需要将一个给定样品的图谱中存在的所有的T-RFs及其峰面积生成一个矩阵。如果一个T-RF没有在一个特定图谱中出现，会分配至为“零”的区域。然后，该数据集会被图谱中计算出的每个峰的总面积的比例标准化。要确定基线，百分比阈值会以这样的方式被选择，即总峰面积和峰数之间的相关性被最小化。之所以这样做，是因为需要控制由于注入DNA量的不同而带来的差异。总峰面积和峰数量间的强相关性表明，更高的DNA注入量造成了阈值以上的较大数量的峰，而不是因为样本中此群落的比重大造成的。

Dunbar介绍的方法也提及了上述问题，注入不同量的DNA可能会影响细菌种群在T-RFLP图谱表现的数量和相对丰度。该方法应用最小峰高作为基础来标准化图谱中的其他峰高。要做到这一点，每个图谱的总峰高的计算仅包括大于25个荧光单位的峰高。数据集中任何样本的总峰值除以最小峰高值，而得到此峰的校正系数。此校正系数被用来调整图谱中的峰值高度，并通过这样做调整DNA注入量的差异。例如，假设20 000 FU是最小峰高，则图谱上总峰高度为40 000 FU的样品的校正系数为0.5。因此，后面的图谱将每个峰值高度乘以0.5。此次修正后，有些峰将低于25 FU的门槛并被去除。随后计算每个图谱而得到一个新的总峰高值，并且这个过程反复进行直至它们每个都等于最小峰高。作者指出，使用25 FU的阈值未能从数据中消除所有干扰，并且这会影响进一步的统计比较。因此，只有标准化后的峰将会做进一步的比较。这种方法是在恒定基线值(25 U)主观选择中优化的方案。

不同的图谱中的电子干扰是不同的，所以使用相同的百分比阈值以消除所有图谱中干扰是不可能的。因此，Osborne［16］提出使用可变百分比阈值来解决这一问题。Sait［18］及Osborne等的方法试图最小化总峰面积与峰数之间的关系。在该方法中，分别为每个图谱确定阈值百分比使之达到最弱的总峰面积与峰数之间关系的结果。Osborne将他们的方法与Sait和Dunbar的两个程序作比较并总结，他们的方法能更好地区分信号与干扰，因为加工后的图谱能够最大程度地精确分组。

统计理论的一种新的统计方法已应用到信号/干扰区分中［19］。使用此程序，数据由每个峰的面积除以该特定样品的总的峰面积而标准化。数据集的标准偏差随后通过假定真实平均值为零而计算出来。峰面积大于平均值的标准偏差3倍的峰被确定为真实信号并被采用。这个过程一直重复直至没有更多的“真实峰”被确定。这种方法倚重于为解决注入DNA不同而采取的图形标准化，而这种标准化导致了一些无法与干扰相区分的小峰的减少。尽管如此，此方法在识别较小的峰时比其他方法更加灵敏，这也可能会导致图谱中各菌群丰度的细微差别。尽管使用基于峰高和峰面积的欧几里德距离可以将这些差异缩小，但基于存在/不存在的矩阵分析可能会放大丰度的差异并可能会产生不准确的结果。

5 图谱的整理与分析

T-RFLP分析不同运行过程中的差异，可能导致对相同菌群的T-RF估计片段大小产生细微差别。因为这种运行间的变化是客观存在的，所以在进行进一步的统计分析之前，必须使图谱保持有效的一致性。用于将不同大小的片段分配给不同的长度分型区(箱体)的方法，包括四舍五入法、人工分区以及基于聚类的统计方法［20］。如果参数的选择是基于贯穿始终的实验数据，则可以应用自动化程序对大数据集进行客观分析，并提供统计学依据，因此，统计方法的使用无疑优于四舍五入及人工分区的方法。

四舍五入是最简单的方法。预计的片段大小被四舍五入至最接近整数，然后每个整数倍视为一个箱。这个方法存在局限性，DNA片段的毛细管电泳分析的误差为±0.5 bp，所以分次运行的相同片段可能被放置于不同的箱中。例如，一个图谱中100.4 bp的片段将被放置于一个100 bp的箱中，而在另一图谱中的该片段可能被测出为100.6 bp，四舍五入后为101 bp并被置于另一个箱中。由于两个片段大小的差异只有0.2 bp，在分组时它们可能本该归于同一类。由于有此问题，对于调整T-RFLP图谱来说，整数法并不适用。

与四舍五入法比较，用人工分区的方法，一个有经验的分析师可在两可的情况下做出正确的选择。人工分区由于存在主观判断误差的可能性，并且不具备高通量分析能力，因此并不推荐。

Hewson和Fuhrman［21］描述了一个箱体化的技术，其特征在于图谱基于固定大小窗口的不同箱体而对齐。在他们的例子中，Hewson和Fuhrman使用10 bp大小作为箱的窗口。如果排除由于引物二聚体峰产生的大小小于50 bp的片段，则第一个箱将包含50～59 bp的所有片段，第二个箱将包含所有大小为60～69的片段，并依此类推。排列进行数轮，且每轮中窗口的起点都要偏移1 bp;即在第二轮排列中，所有片段长度，从51～60 bp，61～70 bp等，被认为是相同的。完成对齐所需要的次数等于箱的窗口的大小，在本例中，需要十次(应当指出，此方法被发展用于使用聚丙烯酰胺凝胶和非毛细管凝胶电泳的片段分析中，由于可能产生较大的运行间差异，因此，提倡使用大的窗口)。对于每一层结构，所有的图谱的两两之间的相似性被计算，在图谱中两两之间的最大相似中构建聚类树(UPGMA)，该树对不同的微生物群落进行勾画。分箱方法只在对未知群落结构的样本检测，因此，这种方法用于确定真实的微生物群落的差异的能力仍然未知。这种分箱方法经Ruan［22］进一步改进后，允许根据片段大小决定不同箱体的窗口大小，因为片段测量的可重复性随片段大小的变化而变化。

Dunbar［17］提出根据片段大小来对齐图谱，例如±0.5 bp。由于这种分析使用毛细管凝胶电泳，所有长度差异小于0.5 bp的片段被认为是相同的并置于同一箱中。这种方法的一个潜在缺陷是，在某些情况下，尺寸差小于0.5 bp的峰可能是客观存在的。为了解决这个问题，Dunbar限制了可以被分配给一个箱对应图谱的峰的最大数目。此方法优于Hewson和Fuhrman开发的方法，因为通过Dunbar的方法，决定两个片段是否属于同一箱体的基础是两个片段大小的差异，而不是它们是否属于一个相同的预设的固定箱的窗口。

Abdo［19］在分析T-RFLP图谱时使用层次聚类的方法。尽管对箱中片段的数目没有限制，这种方法仍然与Dunbar描述的方法相似。首先，所有相关的图谱中的所有片段长度被合并、排序以及删除重复片段。然后，采用聚类树(UPGMA)进行层次聚类，以识别足够接近且可被同一箱体化(例如，±1 bp半径内)的长度片段。聚类程序通过选择两个具有最小尺寸差异的片段启动。将这两个片段进行分组，并形成一个由它们的平均片段大小表示的箱。此程序持续将片段分组至箱，直至没有更多的片段或箱能够满足尺寸差小于定义值的要求。如果一个样本内的片段分在同一箱体，则它们的峰面积相加并视为一个单一的峰。

分析环境中微生物的差别，为法庭科学实践提供有效技术手段和解决思路已成为不争的趋势［23］。尽管T-RFLP技术目前还存在一些缺陷，但仍是最好的微生物多样性分析工具之一。我们相信，随着该方法的进一步完善和设备、试剂的改进，数据库中核酸序列的不断丰富，以及相关标准的制定和实施，TRFLP技术在司法实践中必将得到更加广泛的应用。

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(责任编辑 陈小明)

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本文系吉林省科技厅科技发展计划项目阶段性研究成果(20110424)。

陈尚坤(1969—)，女，吉林长春人，吉林警察学院学报编辑部主任，编审。主要研究方向为微量物证鉴定。