MicroRNA－21在皮肤鳞状细胞癌中的研究现状

广 维 尹新江 综述 何春涤审校

·综述·

MicroRNA－21在皮肤鳞状细胞癌中的研究现状

广 维 尹新江 综述 何春涤∗审校

MicroRNAs是一类能够调控真核细胞生物基因表达的小RNA，已被证实在多种肿瘤中表达失调。MiR－21是目前研究最为广泛的microRNA，几乎在所有实体肿瘤中高表达，最近发现在皮肤鳞状细胞癌(cSCC)中microRNA的表达也有异常。MiR－21通过调控靶基因改变肿瘤细胞侵袭作用，其靶基因主要包括PTEN、PDCD4、RECK等。本文主要介绍了MiR－21在皮肤鳞状细胞癌中的研究现状。

MiR－21； 皮肤鳞状细胞癌； 靶基因； 发病机制

MicroRNAs(miRNAs)是一类长度为20～24个核苷酸(nt)的非编码RNA分子,存在于多种生物的基因组中,通过mRNA剪切或抑制蛋白质翻译发挥其转录后水平调控作用。研究表明miRNA在动植物生长发育、细胞增殖、凋亡和多种人类疾病的发生发展中起到重要作用,其表达模式在多种类型的肿瘤中发生了改变。1一部分miRNA被认定为抑癌基因,另一部分被认定为致癌基因(onco－miRs)。

MiR－21是研究最为广泛的onco－miR,几乎在所有实体肿瘤组织中异常表达,最近确定的皮肤鳞状细胞癌(cSCC)miRNA表达谱也揭示了其异常表达,2miR－21通过调控靶基因改变肿瘤细胞侵袭作用,其靶基因主要包括PTEN、PDCD4、RECK等。近年来关于miRNA在皮肤肿瘤中的研究日益增多,本文将对miR－21在皮肤鳞状细胞癌中的研究现状进行综述。

1 MiR－21的生物学特征及功能

MiR－21位于17q23.2的FRA17B脆性区域上,具有自主转录单位。其转录首先在细胞核内由RNA聚合酶II介导生成pri－miR－21,再由Drosha酶加工成发夹状pre－miR－21,最后被转运至细胞质经Dicer酶剪切为成熟miR－21。1MiR－21在生物体内具有很强的保守性,在人体,前体miR－21 DNA位于l7号染色体重叠基因TMEM49的一个内含子上。MiR－21拥有独立的启动子,表达不受重叠蛋白编码基因启动子的调控,而其他多数miRNA与其重叠蛋白编码基因共用一个启动子。

MiR－21几乎在所有上皮细胞来源的实体肿瘤中过度表达,包括乳腺癌、胰腺癌、肺癌、胃癌、前列腺癌、结肠癌、头颈部肿瘤、食道癌,也在白血病、淋巴瘤、多发性骨髓瘤等恶性血液病及胶质母细胞瘤、骨肉瘤、精原细胞瘤中过度表达。因此,miR－21几乎是唯一一种在所有来源于上皮细胞、结缔组织、造血细胞、生殖细胞或神经细胞的人类主要肿瘤中表达上调的基因,提示miR－21是一个非常重要的致癌基因。

功能抑制实验证实miR－21几乎涉及致癌过程的每一步:促进细胞增殖、侵袭、转移,基因组不稳定和突变、炎症、复制永生、代谢异常、生成血管、逃避细胞凋亡和免疫杀伤。其中,miR－21主要参与了细胞凋亡。Chan等3以反义寡核苷酸抑制miR－21表达,发现胶质母细胞瘤细胞明显减少,caspase－3及caspase－7活性增加3倍,细胞凋亡明显增加,证明miR－21参与了细胞凋亡,其异常表达抑制凋亡相关基因及蛋白的表达,进而促进恶性进展。

2 MiR－21的主要靶基因

每种miRNA都有上百种靶基因,每种mRNA又是不同miRNAs的靶基因,只有明确某种miRNA的mRNA靶基因,才能更深入研究其在肿瘤中的作用。1MiR－21在肿瘤中的表达通常上调,已报道的其靶基因多数是肿瘤抑制基因。目前已证实的miR－21靶基因包括28种,其中三分之二直接或间接参与内源性和/或外源性细胞凋亡途径。4这表明,miR－21是一个在肿瘤细胞抵抗程序性死亡中起着关键的作用致癌基因,靶向细胞凋亡对表达miR－21的肿瘤是一种可行的治疗方式。MiR－21通过调控靶基因PDCD4, PTEN,RECK等影响细胞增殖、凋亡和侵袭,5以下将着重阐述这3个基因。

2.1 PDCD4(Programmed Cell Death 4) 生物信息学分析证实,PDCD4位于miR－21靶定位点,通过与eIF4E结合调控肿瘤细胞增殖、侵袭、转移、分化等过程。6,7在乳腺癌细胞中,miR－21通过刺激一种酪氨酸激酶受体Her2/neu表达上调,在Her2/neu阳性细胞中PDCD4表达下调。6在结肠癌细胞中,miR－21与PDCD4表达水平呈负相关,荧光素酶结构显示miR－21过表达后直接作用于3'UTR,PDCD4启动子活性下调,导致结肠癌细胞侵袭性增加。8此外,宫颈癌和胶质母细胞瘤细胞实验已表明,miR－21直接靶点为PDCD4,从而导致其致癌特性。9,10Asangani等11的一项研究表明AP－1是一种转录因子,在Ras通路中诱导miR－21的表达。Ras通过这一途径抑制PTEN和PDCD4。Aaron等12的研究表明PDCD4抑制翻译起始和AP－1的活性,同时能够降低皮肤乳头状细胞瘤发生及发展为鳞状细胞癌的几率。PDCD4也被证明在LPS诱导的细胞凋亡中起到调节作用。7LPS通路通过Toll样受体4(TLR4)导致PDCD4表达增加,并通过IL－6和NF－κB诱导细胞凋亡,该过程依赖于PDCD4的表达。此外,NF－κB还诱导miR－21的表达,针对PDCD4形成负反馈,PDCD4以这种方式回应外来信号,诱导细胞凋亡。虽然LPS信号在肿瘤发生过程中不同于凋亡信号,但是PDCD4和miR－21为炎症和肿瘤的发生提供了重要的联系。

2.2 PTEN(Phosphatase and Tensin Homolog) 是一种磷酸酶和肿瘤抑制基因,通过使磷酸肌醇－3－激酶(PI3K)去磷酸化而抑制Akt通路,13PI3K途径活跃于多种肿瘤并且对细胞存活起调节作用。MiR－21介导PTEN表达已经在多种肿瘤细胞系中得到验证。Meng等14的实验表明,在肝癌细胞中当miR－21受到抑制时,PTEN基因的表达增加,肿瘤细胞增殖,迁移和侵袭能力均减弱。此外,miR－21转染的非肿瘤细胞迁移增加。MiR－21通过3'UTR直接作用于靶基因PTEN。PTEN通过调节MMP－2和MMP－9参与细胞迁移和侵袭,MMP－2和MMP－9的活性同样受到miR－21表达量的影响。Fak参与维持细胞活力和生存,其活性也受到PTEN和miR－21调节。

PTEN基因缺失和突变的小鼠容易诱导肿瘤。PTEN敲除小鼠的细胞增殖能力增强,抗凋亡,干细胞更新/维持,着丝粒不稳定,DNA双链断裂,15提高对致癌物质的敏感性和二次遗传或表观遗传的改变,导致皮肤癌的发生。Suzuki等16利用Cre－loxP系统培育角质形成细胞PTEN基因敲除的突变小鼠(k5PTEN FLOX/FLOX小鼠)。所有突变小鼠在出生后8.5个月内自发生长肿瘤。k5PTEN FLOX/FLOX角质细胞过度增殖和抗凋亡,PTEN的下游信号传导介质Akt/蛋白激酶B(PKB)和细胞外信号调节激酶活性增加。证实PTEN基因对皮肤正常发育和肿瘤发生具有重要调节作用。

PTEN种系突变与遗传性肿瘤有关。然而,Pezzolesi等17发现无论胚系突变的状态,癌症表型主要受到miR－21调节的PTEN基因影响。总体来说,PTEN可以通过调控TNF－α信号通路作用于外源性凋亡,通过调控线粒体凋亡因子的表达作用于内源性凋亡。

2.3 RECK(Reversion－inducing cysteine－rich protein with Kazalmotifs) 是一种基质金属蛋白酶抑制剂。通过抑制MMPs降解基底膜导致癌细胞转移,从而在抑制肿瘤细胞浸润、转移及血管生成中起到重要作用。在转录后水平,RECK至少能够调节3种基质金属蛋白酶,其中MMP－2和MMP－9是肿瘤浸润转移过程中涉及到的关键蛋白水解酶。RECK可抑制pro－MMP(MMP－9的前体形式)的分泌,而膜锚定的RECK与可溶RECK联合,并相互作用,既可抑制MMP－9,也可以抑制MMP－2、MMP－14的活性,从而抑制血管新生,诱导肿瘤细胞凋亡。18

RECK在经癌基因fos、ras、myc等转染后均呈现不表达或低表达,说明RECK或许是癌基因共同作用负调节靶点,癌基因可造成RECK表达的下调。19MiR－21是目前研究最为广泛的onco－miR,在胃癌细胞、胶质母细胞瘤、骨肉瘤和前列腺癌中已证实RECK为miR－21的靶基因,miR－21通过3｀－UTR区直接作用于RECK,二者表达量呈反比。20,21MiR－21通过增加MMPs促进肿瘤细胞转移,因此抑制miR－21通过增加RECK的表达降低MMPs的活性,导致细胞运动和侵袭能力减弱。9此外,RECK的表达水平可用于多种常见肿瘤的预后评估,在肿瘤组织中RECK高表达的患者预后一般较无表达的好,RECK低表达常与肿瘤侵袭与不良预后相关。22,23

3 MiR－21与cSCC

cSCC是常见的皮肤癌,发病率仅次于皮肤基底细胞癌,在每年新发病的皮肤肿瘤患者中cSCC占10%以上。2460%的cSCC发生在头颈部,多数皮损面积小,局限,经过手术治疗容易控制,较大且侵袭性较强的皮损则需要多方面治疗。14%头颈部较大复发皮损的死亡率高达40%,然而关于cSCC发病的分子机制仍不明确。大量研究确定了一系列与cSCC发生发展有关的分子,如p53,cyclin D1,BRCA2,FAS, VEGF,Wnt－1,DEC1和microRNA,但是这些分子具体如何发挥调控作用尚不明确。

MicroRNA作为一种重要的能够调控分化、侵袭、凋亡的非编码RNA,在皮肤中的研究日益增多,这些研究主要集中在miRNA对皮肤形态发育和肿瘤形成的潜在作用。最近的研究结果证实miRNA参与毛囊形态生成(miRNA在表皮和毛囊差异表达),皮肤自身免疫性疾病,慢性炎症性疾病(银屑病,红斑狼疮, ITP),伤口愈合和皮肤肿瘤的发病。25

MiR－21作为一种致癌基因,已在多种肿瘤中被广泛研究,包括非cSCC,口腔和食管的鳞状细胞癌和喉癌,其在cSCC中的研究仍处于起步阶段。Dziunycz等26首先基于实时反转录酶PCR分析,在免疫功能正常和接受器官移植的cSCC受试者中检测了一组近年来被报道在角质形成细胞中具有功能的miRNA,包括miR－21,miR－184,miR－203和miR－205。发现与正常皮肤相比,cSCC的miR－21和miR－184表达显著增加,miR－203表达显著下降。UVA照射的皮肤角质已被证实导致miR－21过量表达,而UVB辐射对miR－21的表达几乎没有影响。27MiRNA表达谱的失调已在多种SCCs中被证实,近来cSCC的miRNA表达谱被Sand等2通过微阵列芯片扫描的确定,结果显示18个miRNA表达下调,包括miR－21在内的13个miRNA表达上调。

Grhl3作为保守进化的Grainyhead转录因子,在调节表皮分化过程中发挥重要的调节作用,近年来在cSCC发病机制中被逐步研究。Bhandari等28研究发现Grhl3敲除小鼠表皮分化障碍、多向分化基因表达减少,分析其皮肤miRNA表达谱,确定了包括miR－21在内的11种miRNA差异表达,Grhl3表达下降后miR－21表达上调,进而导致cSCC发生。Darido等29进一步确定PTEN是Grhl3发挥抗肿瘤效应的关键下游基因。MiR－21癌基因网络同时靶向作用于Grhl3和PTEN,放大PI3K/Akt/mTOR信号,诱导cSCC。此外,Grhl3/PTEN基因缺乏的cSCC对PI3K/Akt通路呈现易感性,同时伴有MAPK/ERK通路表达下调。

骨形态发生蛋白(BMPs)在控制皮肤的发育,组织重塑和肿瘤发生中发挥重要作用。Ahmed等30的实验表明miR－21通过调节选择性BMP靶基因(同时也是miR－21靶基因)的表达,参与BMP通路在角质形成细胞中发挥作用。虽然角质形成细胞中完整的miR－21靶基因表达谱还有待进一步研究,但有些基因(PTEN,PDCD4,TIMP－3和TPM－1)已确定作为肿瘤抑制基因同时受BMP4和miR－21的调节。PTEN, PDCD4,TIMP－3和TPM－1已被证明在miR－21作用下表达下调。6,9RECK和TIMP－3也被证实在肺鳞癌中表达下调,有证据表明在cSCC转基因小鼠模型中PDCD4表达下调,舌SCC中miR－21介导TPM－1表达下调。27PTEN在皮肤中的表达缺失有助于肿瘤发展,16而表皮中PDCD4过表达将抑制肿瘤生长。12TIMP－3和TPM－1通过调节上皮－间质相互作用、抑制细胞运动和肿瘤侵袭,从而抑制肿瘤生长。4然而miR－21是否在cSCC中通过诱导PTEN,RECK,PDCD4,TIMP－3或TPM－1表达下调发挥致癌作用有待进一步研究确定。

化学刺激致小鼠皮肤癌模型是研究cSCC的重要方法,所使用试剂多为DMBA/TPA。Ma等31建立miR－21等位基因敲除的小鼠模型,并以DMBA/TPA刺激小鼠皮肤,发现与野生型小鼠相比,miR－21缺失的小鼠乳头状瘤的形成显著减少,细胞凋亡增加,细胞增殖能力降低。此外,还发现在miR－21缺失的角质形成细胞中存在大量已验证或预测的miR－21靶基因表达上调,而角质形成细胞正是皮肤乳头状瘤的前体细胞,cSCC同样源于角质形成细胞的恶性增殖。当miR－21缺失后Spry1,PTEN,PDCD4上调,同时ERK,Akt,JNK磷酸化减少,这3种蛋白是活化后Ras的主要下游效应因子,在DMBA诱导的皮肤癌中发挥主导作用。这些结果证明miR－21通过负向调节靶基因减弱了Ras抑制肿瘤的三大旁路途径效应,从而在体内发挥其致癌作用。

综上所述,miR－21可能通过调节靶基因PTEN, RECK,PDCD4,TIMP－3或TPM－1等在cSCC发病中发挥重要作用,但是需要进一步研究证实。

4 展望

临床研究证据显示许多miRNA在多种肿瘤中表达上调或下调,某些miRNA表达水平与疾病的阶段相关。现有研究表明,miR－21高表达与头颈部SCC和消化系统肿瘤的总体生存率相关。32因此,miRNA可作为潜在的肿瘤诊断和预后的标志物。

此外,由于miRNA在癌症和其他人类疾病中的关键作用,其用于靶向治疗具有很大潜力。与miRNA序列互补的寡核苷酸体积小(19－24 nt),例如,miRNA拮抗剂,能有效地阻止miRNA在体内的功能,而miRNA模拟物可以提高miRNA的功能。现有的siRNAs体内传输策略可以方便地应用于miRNA拮抗剂和miRNA模拟物。这些进展为不久将来以miRNA为基础药物的开发奠定了基础铺平了道路。由于给药途径方便,预计皮肤相关疾病将最先应用以miRNA为基础的药物进行治疗。MiR－21作为目前研究最为深入的miRNA,其表达可作为cSCC的一种潜在治疗靶点,但是关于其信号转导通路的了解仍处于早期阶段。MiR－21的下游基因、基因网络及上游因子都需要大量深入的研究来确定。

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(收稿:2013－04－01)

An update ofm icroRNA－21 in cutaneous squamous cell carcinoma

GUANGWei,YIN Xin-jiang,HEChun-di.Department ofDermatology,The First Affiliated Hospital ofChina Medical University,Shenyang,110001

MicroRNAs are a class of small RNAs that are capable of regulating the expression of gene in eukaryotes.microRNAs have been shown to be dysregulated in the progression of various cancers.MiR－21 was identified to be strongly expressed inmany solid tumors.Them iRNA expression profilesof cSCC has been detected recently.It refered thatmiR－21 was overexpressed.It has been shown thatmiR－21 regulates tumor cells invasiveness by controlling target genes,which include PTEN,PDCD4,RECK et cetera.This paper introduces the research on the current state of relation between microRNA－21 and cutaneous squamous cell carcinoma.

MiR－21；cutaneous squamous cell carcinoma；target gene；pathogenesis

中国医科大学附属第一医院皮肤科,沈阳,110001

∗通信作者