HPV病毒库与尖锐湿疣复发关系的研究

刘文慧 栾 红夏超锋

HPV病毒库与尖锐湿疣复发关系的研究

刘文慧 栾 红∗夏超锋

目的: 检测尖锐湿疣(CA)患者及健康查体者宫颈或尿道口,肛周是否存在人乳头瘤病毒,探讨CA患者人乳头瘤病毒亚临床感染与复发的关系。方法: 根据临床及病理结果,收集215例女性CA患者、184例男性CA患者及125例健康查体者的宫颈/尿道口和肛周拭子标本。基因芯片技术检测HPV病毒及其亚型。结果: CA患者中,女性阳性率为46.5%(100/215),正常对照组女性阳性率为6.2%,差异有统计学意义。男性CA患者阳性率为32.6%,正常对照组男性1.7%,差异有统计学意义。男性和女性CA高复发组均以HPV6/11型为主,低复发组以HPV16/18型为主。结论: CA患者存在HPV病毒感染的潜在病灶可能是CA复发的原因之一。

HPV病毒库； 尖锐湿疣； 复发

尖锐湿疣(CA)是由人乳头瘤病毒引起,易侵犯黏膜、表皮上皮细胞,产生包括良性病变(CA、癌前病变)、恶性肿瘤在内的多种疾病。目前已鉴定的HPV约有100余种亚型,能引起CA的亚型主要为HPV6、11、16、18、31、33、35、45、51等30余种,根据致癌危险性大小,将其分为高危型(如HPV16、18、31、33、35、39、45、51～53等)和低危型(如HPV6、11、42～44等)。本研究利用基因芯片技术检测女性CA患者外阴、宫颈、男性CA患者尿道口、肛周存在HPV病毒感染的潜在病灶,可能是CA复发的重要原因之一,为探讨CA复发的相关机制及其治疗提供新思路,现报道如下。

1 资料与方法

1.1 病例选择 所有CA病例均来自2009年1月至2011年1月我院皮肤科、妇科、肛肠科门诊,女性215例,男性184例,均符合CA的临床诊断标准,随访1年,根据随访期间复发次数的不同,分为高复发组(≥5次)和低复发组(＜5次),高复发组年龄18～53岁,平均31.7±2.8岁,低复发组年龄21～59岁,平均35.8 ±3.1岁,所有患者均有CA的典型临床表现,醋酸白试验阳性,并经组织病理确诊。

排除标准:妊娠及哺乳期妇女、严重心、肝及肾疾病或全身衰竭、肿瘤、自身免疫性疾病或合并其他性传播疾病患者。1年内未使用免疫增强剂或免疫抑制剂。两组年龄相比无统计学差异。

对照组:选择女性健康查体者65名,男性健康查体者60名,为与CA患者性别、年龄、职业相匹配的健康查体志愿者。年龄18～51岁,平均29.6±3.3岁。与病例组年龄相比无统计学差异。

1.2 方法

1.2.1 标本采集及处理 外阴常规消毒后,2%利多卡因局部麻醉,用剪刀留取米粒大疣体,置于不同的微量离心管,－20℃冻存。窥阴器暴露宫颈或尿道口,棉拭子清除宫颈口或尿道口分泌物,取出宫颈刷置于宫颈口或尿道口,顺时针旋转4～5周,将宫颈刷头部放入洗脱管中,折断宫颈刷柄,旋紧洗脱管盖,做好标本标识,直立放置洗脱管,－20℃冻存。将宫颈刷在洗脱管中充分漂洗后,把洗脱液全部转移到1.5 mL微量离心管中,13 000 r/min离心10 min,弃去上清,保留管底的细胞块。加入50μL裂解液悬浮沉淀,100℃水浴加热10 min,13 000 r/min离心10 min,保留上清液待用。

1.2.2 检测方法 人乳头瘤病毒分型基因检测试剂盒及相关试剂均由亚能生物技术(深圳)有限公司提供,严格按照试剂盒说明操作。(1)PCR扩增:取PCR反应管做好标记,5000 r/min离心2 min,而后加入已提取的待测样品DNA 5μL,反应总体系为25 μL。按以下条件扩增:50℃,15 min；95℃,10 min；然后以94℃,30 s；42℃,90 s；72℃,30 s共40个循环；72℃延伸5 min。(2)杂交:取15 m L塑料离心管,放入标有患者编号的膜条,加入A液(2×SSC,0.1% SDS,pH 7.4)5 mL及所有PCR产物,混匀将离心管放入沸水浴中加热10 min,放入杂交箱51℃杂交1 h。(3)洗膜:取出膜条,移至有预热B液(0.5×SSC, 0.1%SDS,pH 7.4)的50 mL管中,于51℃轻摇洗涤15min。(4)显色:用A液配制1∶2000的POD溶液,室温轻摇浸泡30 min,弃去POD溶液。用A液室温轻摇洗2次,每次5min。用C液(0.1moL柠檬酸钠, pH 5.4)室温洗膜1～2 min。将膜条浸泡于显色液中避光显色15 min左右即可观察结果。

1.2.3 结果判断 倒去显色液,用清水冲洗1次膜条,将膜条置于基因芯片阅读仪上进行结果扫描。膜条上探针按固定顺序排列,有蓝色斑点显现位置即可断定HPV的亚型。其中高危型包括:HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73、83、MM4；低危型包括:HPV6、11、42、43、44。膜条在PC位点处有蓝色斑点出现视为有效；阴性对照膜条应除PC点位置外无蓝色斑点出现,否则有可能是发生污染或实验不成功。

1.2.4 统计学方法 实验数据采用SPSS 11.5统计软件进行处理。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 399例CA患者中,共有163例检出HPV病毒,阳性率为40.9%(163/399)。其中215例女性外阴CA患者中,共有100例宫颈中检测出HPV病毒,阳性率为46.5%(100/215),高复发组中67.3%(70/ 104)检测出HPV病毒,低复发组中34.2%(38/111)检测出HPV病毒；正常对照组女性6.2%(4/65)检测出HPV病毒,女性高复发组阳性率高于低复发组(χ2＝10.2,P＜0.05)和正常对照组(χ2＝50.0,P＜0.05)。184例男性CA患者中,共有63例尿道口中检测出HPV病毒,阳性率为32.6%(60/184),高复发组中43.3%(26/60)检测出HPV病毒,低复发组中27.4% (34/124)检测出HPV病毒,正常对照组男性1.7%(1/60)检测出HPV病毒,高复发组阳性率高于低复发组(χ2＝9.7,P＜0.05)和正常对照组(χ2＝32.1,P＜0.05),差异有统计学意义。

2.2 女性外阴CA患者共检出15种HPV基因亚型,检测结果与宫颈HPV亚型基本一致。高复发组以HPV6/11型为主(42/70,60.0%),低复发组以HPV16/18型为主(14/38,36.8%)。男性CA患者共检出11种HPV基因亚型,检测结果与尿道口HPV亚型基本一致。高复发组以HPV6/11型为主(14/ 26,53.8%),低复发组以HPV16/18型为主(12/34, 35.3%)。

3 讨论

CA又称生殖器疣或性病疣,是由人乳头瘤病毒引起的人生殖器部位及其附近表皮的一种良性乳头瘤样增生性疾病。人乳头瘤病毒,是一种DNA病毒,具有高度的宿主和组织特异性,人类是唯一的自然宿主,HPV病毒感染人体后,不经血流扩散,不产生系统感染,仅在局部引起亚临床感染、潜伏感染及CA。2现已公认HPV感染是宫颈癌的主要病因,其中高危型HPV持续感染与宫颈上皮内瘤变及宫颈癌之间有着明确的相互关系。3HPV感染和与HPV有关的癌常是慢性免疫功能受抑制者的晚期并发症。

本研究结果显示,女性外阴CA患者宫颈可能存在潜在的HPV感染病灶,并且主要为HPV6/11型,而HPV6/11型复发率较16/18型高,说明该组的高复发率可能是由于宫颈内存在亚临床的HPV感染灶所引起的,这些亚临床感染灶中的HPV病毒完全可能通过月经、外阴分泌物等途径感染下游的外生殖器。而低复发组虽然复发率较低,但是由于其主要感染的是HPV16/18型,属于易复发亚型,并且往往周期较长,因而,随着时间的推移,该组的复发率可能会有进一步的增加。男性CA患者尿道口也检测出潜在的HPV病毒感染灶,这些亚临床感染灶中的HPV病毒可能通过包皮过长、分泌物等途径感染到包皮及冠状沟等处。值得注意的是,正常对照人群中也出现HPV感染,虽然经体格检查,并未发现有明显癌肿的存在,并均否认非婚性接触史,仍需进一步观察。

临床上治疗CA并不困难,可各种治疗方法都不能避免CA的复发,且发病率逐年上升,CA复发的因素相当复杂。要针对相关的原因进行治疗,首先采用适当的治疗方法充分去除临床可见的疣体,积极消除不利因素,提高机体免疫力,同时去除HPV亚临床感染和隐性感染,对减少CA的复发有一定的重要意义,从而达到彻底治愈CA的目的。

1 Da Ros CT,Schmitt Cda S.Global epidemiology of sexually transmitted diseases.Asian JAndrol,2008,10:110－114.

2赵辨.临床皮肤病学.3版.南京:江苏科学技术出版社,2001. 535－536.

3 Che YM,Wang JB,Liu YH.Correlation between deoxy ribo nucleic acid loads of human papillomavirus and recurrence of condyloma taacuminata.Int JSTD AIDS,2005,16(9):605.

4马彩玲,李轶杰,张富春,等.应用荧光定量聚合酶链方法检测宫颈组织中人乳头瘤病毒16E6基因.中华医学杂志, 2004,84(6):469－473.

(收稿:2012－04－07)

Relationship between subclinical hum an papilomavirus infection and recurrence of condyloma acum inatum

LIUWen-hui,LUANHong,XIAChao-feng.LiaochengPeople'sHospi tal,252000

Objective:To investigate the relationship between subclinical human papilomavirus(HPV)infection and recurrence of condyloma acuminatum(CA).Methods:A total of 215 female patients,184 male patients with CA and 125 healthy persons were recruited in the study.The swab samples were collected from cervix urethra and perianal area；Gene chip technology was used to detect the presence of HPV virus and its subtypes.Results:While the positivity rate ofHPV in female patientswith CAwas46.5%(100/215),itwas 6.2%in the normal control group,with a significant difference.The positivity rate ofmale patients with CA was 32.6%,and 1.7%in normal controls,with a significant difference.The predominated sub－type of HPVwas HPV6/11 in higher recurrent groups both in male and female patients with CA and HPV16/18 type predominated in lower risk recurrent groups both inmale and female patients.Conclusion:The sub－clinical HPV infection may contribute to the recurrence of CA.

HPV infection；condyloma acuminatum；recurrence

山东省聊城市人民医院,252000∗通信作者