干细胞移植治疗脊髓损伤研究与临床应用

邢 冉，陈旭义，刘英富，朱 祥 综述，涂 悦 审校

脊髓损伤(spinal cord injury，SCI)是中枢神经系统(central nervous system，CNS)的严重创伤，有很高的致残率和致死率。SCI 会造成患者损伤平面以下肢体运动和感觉功能不同程度的丧失。其主要原因是SCI 后神经元和胶质细胞死亡，大量的轴突变性及弥漫性的脱髓鞘病变，影响脊髓功能。目前研究发现在适当的生长环境下，中枢神经系统内的一些受损的神经元轴突会有少许再生，因此，SCI 的治疗策略中最重要的就是神经保护和神经再生。大量研究发现干细胞具有多向分化潜能，在一定条件下能分化为神经系细胞，干细胞移植治疗SCI 成为一种具有前景的方法。干细胞移植治疗SCI 的机制为:(1)通过分泌多种神经营养因子改善局部微环境，为轴突或神经元再生提供必要条件;(2)替代或提供新的神经元从而形成新的突触联系;(3)桥接脊髓损伤断端，结合组织工程支架技术引导轴突至支配靶点，形成功能性突触，重新建立新的神经传导通路;(4)使损伤的脱髓鞘轴索再髓鞘化，恢复有髓神经电传导功能［1］。基础实验及临床研究证实单细胞移植和细胞联合移植都取得一定的疗效，成为治疗SCI 的新手段。

1 单细胞移植

根据干细胞的来源和基本特征，主要分为胚胎干细胞(embryonic stem cells，ESCs)及成体干细胞(adult stem cells，ASCs)。其中ASCs 存在于成体的许多组织和器官，具有修复和再生的能力。在SCI 的干细胞移植治疗中，主要应用到的ASCs 包括神经干细胞(neural stem cells，NSCs)、骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)、嗅鞘细胞(olfactory ensheathing cells，OECs)、脂肪间充质干细胞(adipose-derived stem cells，ADSCs)和脐带血间充质干细胞(umbilical cord blood mesenchyme stem cells，UCBMSCs)等。

1.1 胚胎干细胞 ESCs 是来源于哺乳动物早期胚胎内细胞团(inner cell mass，ICM)中的一种二倍体细胞，具有长期的未分化增殖能力，在特定的条件下，能够向3 个胚层(内、中、外)的组织和细胞分化。Mc Donald 等［2］通过移植小鼠ESCs 来治疗SCI，他们将小鼠ESCs 移植到大鼠胸段脊髓挫伤处，发现这些ESCs 能够分化为神经元、少突胶质细胞和星形胶质细胞，并且大鼠后肢功能得到明显恢复。Bottai［3］等将未分化的ESCs 经尾静脉注射移植治疗到脊髓损伤的小鼠，发现移植28 d 后小鼠的运动功能有明显改善。以上实验都证明ESCs 移植能够分化为少突胶质细胞或星形胶质细胞，使脱髓鞘的神经再髓鞘化，或分化为神经元与宿主神经元建立突触连接，从而修复受损的神经功能。但是，ESCs存在许多不足之处，如移植后的免疫排斥反应、潜在的成瘤性及伦理学问题等，这些都导致临床应用的局限性。

1.2 神经干细胞 NSCs 是指存在于神经系统内的具有自我复制能力和多向分化潜能的细胞群，而NSCs 还包括可以修复和替代自身组织的内源性神经干细胞(endogenous neural stem cells，ENSCs)。目前已经成功从胚胎哺乳动物的脊髓、脑皮质、纹状体和成年哺乳动物的室管膜下层、室下区、侧脑室、脑皮质及脊髓等区域分离培养出NSCs。Abematsu M 等［4］在脊髓损伤研究模型中证明了NSCs 移植能够改善脊髓损伤症状，促进后肢功能的恢复。Romanyuk N 等［5］将人类胎儿的NSCs 移植治疗SCI，结果发现移植的细胞在损伤部位存活，并且分化为运动神经元提高运动功能;Azari等［6］的研究证实:SCI 后1 w，损伤节段横切标本中nestin 阳性细胞计数明显多于对照组，说明脊髓损伤作为刺激因素，可以激活ENSCs，并诱导ENSCs 向损伤区域迁徙。虽然NSCs 移植在治疗脊髓损伤中取得较好的效果，展现了广阔的临床应用前景。但是仍然存在一些问题需要解决。如:成体神经干细胞数量少、增殖能力有限、且随着培养时间的延长分化能力下降等问题。

1.3 骨髓间充质干细胞 BMSCs 是指来源于骨髓组织的一种能在体外培养、扩增的多能干细胞，具有干细胞的特性。有研究发现BMSCs 能够分泌神经营养因子，抑制炎性反应，诱导神经轴突生长，促进神经功能恢复。Nakajima H等［7］将人骨髓间充质干细胞(hBMSCs)移植到SCI 大鼠脊髓损伤处，结果发现在SCI 后的急性期移植hBMSCs，使巨噬细胞的形态从经典活化的巨噬细胞(Ml 型)转化成替代型活化的巨噬细胞(M2 型)，从而导致SCI 后炎性环境的改变，减小SCI 后空洞面积，抑制瘢痕组织的影响，促进轴突再生从而促进功能恢复。Park JH 等［8］从10 个SCI 患者的髂骨中获得BMSCs，在经过4 w 的培养后直接注射到患者的损伤部位，6个月后发现有3 个患者的活动能力及电生理表现都有改善，说明自体BMSCs 移植对治疗SCI 有效。与其他移植细胞相比，BMSCs 具有良好的体内、体外神经分化潜能，但作为BMSCs 来源的骨髓组织可随老化而导致干细胞含量及其增殖能力的降低。

1.4 嗅鞘细胞 OECs 又称嗅鞘胶质细胞，起源于嗅球基底膜，是存在于嗅觉系统中具备终生再生分裂能力的非神经元细胞，并兼有星形胶质细胞和雪旺细胞的特性，OECS 通过分泌多种神经营养因子来促进神经元细胞轴突的生长。Tharion G［9］从成年大鼠的嗅粘膜提取出OECs，将其培养一段时间后移植到SCI 大鼠的损伤节段。2 w 后，对大鼠四肢肌肉的运动功能恢复情况进行评估，结果发现OECs 组的运动诱发电位要优于未处理组，这证明治疗SCI 可以用OECs移植。马昌科等［10］采用Meta 分析方法对OECs 移植修复大鼠及人类SCI 的效果进行分析，结果显示OECs 移植有利于SCI 大鼠脊髓再生，能够促进大鼠后肢运动的恢复。同时SCI 患者在OECs 移植后运动、轻触觉及痛觉功能有明显提高，说明OECs 移植也能够促进SCI 患者脊髓的修复。虽然目前在OECs 移植治疗脊髓损伤SCI 的基础研究和临床应用都取得一定的成果，但由于这项工作尚处于起始阶段，有许多问题需要解决，如移植的最佳时机、来源及提纯等。

1.5 脂肪间充质干细胞 ADSCs 是指存在于脂肪组织中的间充质干细胞，具有多向分化潜能，在适当条件下可以向脂肪细胞、神经细胞及成骨细胞等定向分化。Oh JS［11］等将ADSCs 注射到大鼠脊髓损伤区域，发现该部位新生血管密度要高于对照组，且CD 31 表达增加，动物肢体运动功能评分也有明显改善，表明移植的ADSCs 可以通过促进局部新生血管形成而起到脊髓保护作用。Ryu［12］等将ADSCs 和基质胶的混合物移植到犬SCI 部位，免疫组化染色可见一些细胞表达神经元标记NF160 及星形胶质细胞标记GFAP。Ra［13］等对8 例男性SCI 患者进行自体ADSCs 移植的临床试验，12 w 后显示患者的感觉及日常生活活动能力得到改善，这在一定程度上提示ADSCs 移植的有效性。ADSCs 具有取材方便、来源广泛、增殖速度快、且体外培养简单等优点，但同时需要进一步验证异体移植的安全性。

1.6 脐带血间充质干细胞 UCBMSCs 是指来源于脐带血中的一种多潜能干细胞，具有很强的生命力，在体外一定的诱导条件下可分化为各种神经样细胞。有研究者在脐带血中找到了经诱导可分化表达神经元和神经胶质细胞标志物的细胞，由此可见，UCBMSCs 可以作为干细胞用来治疗SCI。Schira［14］等将从人脐带血中分离出来的成体干细胞移植到大鼠脊髓损伤部位，结果发现干细胞生长因子在损伤部位聚集，并且有功能性运动的改善，实验证明HUCBMSCs 移植对脊髓损伤有治疗作用。卢桂兰［15］等对22 例SCI 患者进行UCBMSCs 治疗，结果发现实验组的肌力、肌张力、感觉及膀胱直肠功能等要优于对照组，证明对于不完全性的SCI 患给予UCBMSCs 移植联合康复综合训练，预后较佳。UCBMSCs 与其他细胞相比具有来源充足、取材方便及免疫原性低等优点，是治疗SCI 的研究热点。同时也存在一些问题，需要进一步的研究解决。此外，还有其他一些细胞可供选择。如:胎盘间充质干细胞、肌源性干细胞、表皮神经嵴干细胞、外周血干细胞、少突胶质细胞和雪旺细胞(schwann cells，SCs)等，但治疗所需的理想细胞量、移植效果的维持时间以及如何应用神经生长因子、免疫抑制剂等一系列问题，尚需深入研究。

2 细胞联合移植

近年来研究发现，各种单细胞移植都取得一定的成效，但由于自身的局限性均存在许多缺陷，因此细胞联合移植成为了研究的趋势。目前关于SCI 的细胞联合移植主要有NSCs 与OECs、NSCs 与SCs、BMSCs 与OECs、BMSCs 与SCs、OECs 与SCs、SCs 与UCBMSCs 等曾芳俊［16］将NSCs 和OECs 联合移植用来治疗SCI，结果表明联合移植组的大鼠脊髓坏死的面积及损伤区最大横径均要小于治疗前，说明NSCs 与OECs 联合移植可以有效改善SCI 微环境。Xia L［17］等将NSCs 和SCs 两种细胞联合PLGA 支架共同移植到大鼠脊髓损伤部位，结果发现NSCs 可以在PLGA 支架中生存，并且与SCs 共同培养可促进NSCs 向神经元方向分化，并更好的改善脊髓损伤后的运动功能障碍。吴立生［18］等将OECs 和BMSCs 共同移植到SCI 大鼠的损伤部位，通过功能恢复状况评定及对标记后的脊髓进行示踪，结果显示OECs 和BMSCs 在体外可联合培养，且联合移植的修复作用要优于单细胞移植。有学者将BMSCs 和SCs共同移植到SCI 大鼠脊髓损伤部位后进行BBB 评分及撤离触诱发痛阈值测试，结果显示BMSCs 与SCs 联合移植可以提高SCI 后功能的恢复，但是进行减少细胞移植时异常性疼痛的研究［19］。Fouad［20］等将OECs、SCs 和软骨素酶联合植入脊髓损伤的大鼠体内，结果联合移植组功能获得很大恢复，轴突髓鞘化和纤维网状化效果显著，并根据各自的特性推断其可能是由于OECs 使再生的轴突在损伤区形成连接，软骨素酶减少神经疤痕的抑制作用，SCs 为轴突再生提供基础物质，从而达到功能上的互补。周先虎［21］等将激活态雪旺细胞(ASCs)与HUCBMSCs 联合移植在SCI 大鼠的损伤部位，实验结果显示ASCs 与HUCBMSCs 共移植后，HUCBMSCs 可向神经元和少突胶质细胞分化，有利于神经轴突的再生和突触间的连接。细胞联合移植治疗脊髓损伤有巨大的发展潜力，同时也存在一些问题需要解决。如:联合移植的定向分化诱导、联合移植的安全性、功能恢复的评价标准等。相信随着研究的一步步深入，这些问题也会得到解决，为脊髓损伤的治疗提供新的希望。

3 诱导性多能干细胞

诱导性多能干细胞(induced pluripotent stem cells，IPSCs)是指不同来源的分化组织细胞，通过某种转录因子的调节而发生基因改变，转化为具有ESCs 特性和功能的多能干细胞。2006 年Takahashi K［22］等利用反转录病毒等载体，将Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc 4 种基因转染到大鼠胚胎和成体成纤维细胞中，经测定该细胞能够像干细胞一样具有分化和增殖能力。Kobayashi Y［23］等将人IPSCs 移植到普通狨猴损伤脊髓部位，结果显示SCI 中心的神经丝蛋白-200 免疫阳性，证明SCI 后移植人IPSCs 可促进轴突再生。Nori 等［24］将人IPSCs 来源的神经球移植治疗小鼠SCI，结果显示小鼠运动功能有明显恢复，移植细胞与宿主细胞间形成突触，有轴突再生、髓鞘形成和血管发生。Tsuji 等［25］将人源IPSCs 分化产生的神经上皮样细胞移植到联合免疫缺陷小鼠受损的脊髓中，细胞存活并且分化为神经细胞，促进了小鼠后肢的功能恢复。该结果表明IPSCs 移植可以提高甚至恢复脊髓损伤小鼠的功能。IPSCs 最大的优点就是使种子细胞的获取更加简单，同时解决了目前临床上缺乏移植细胞定向分化的技术及免疫排斥等问题，但仍有一些问题需要注意:移植IPSCs衍生的各种神经细胞的安全性及移植后治疗效果的评价。

4 结语

综上所述，单细胞移植和细胞联合移植都能够促进干细胞在体内的存活、增殖和分化，对脊髓损伤均有一定的疗效，行为学检查也有一定的运动、感觉功能的改善。特别是IPSCs 具有广阔的发展前景。但尚有很多问题亟待解决:(1)如何确定最好的干细胞来源;(2)与宿主整合问题;(3)给药途径问题;(4)移植时机问题;(5)如何发展大规模的人工技术满足临床需要并得到政府的统一调控及支持等。但相信随着各种干细胞移植技术的发展及策略的应用，人类一定可以解决干细胞移植中存在的各种问题，为广大脊髓损伤患者带来健康福音。

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