细胞外酸性环境对大鼠冠状动脉环静息张力的影响及其与钾通道阻断剂的关系1）

李江涛，刘 宇，牛龙刚，崔丽娟，侯晓敏，李金艳，郭永强，张明升

人体正常的代谢和生理功能只有在酸碱度适宜的环境中才能维持，正常人体动脉血的pH 为7.35～7.45［1］。如病人有心脏疾病时，使乳酸增加，产生酸中毒。酸中毒又可以影响心脏功能［2］，导致心血管系统功能障碍，严重时可发生休克。钾通道广泛分布于血管平滑肌细胞［3］，并对血管张力的调节起着重要的作用。分布在冠脉平滑肌细胞上的电压依赖性钾通道（KV）、ATP敏感性钾通道（KATP）和钙激活钾通道（KCa）在冠脉调节的各个方面起着重要的作用，并与心脏疾病的发生有密切的关系［4］。细胞外酸性环境可收缩大鼠冠状动脉环［5］，其收缩可能与阻断Cl－通道、Na＋／H＋交换、Na＋／Ca2＋交换、Ca2＋通道、一氧化氮生成和诱发内钙释放有关。但是，细胞外酸性环境收缩大鼠冠状动脉是否与K＋通道有关，却尚未见报道。本实验拟采用离体血管环实验方法，观察不同pH 值对大鼠离体冠状动脉静息张力的变化，并初步探讨其与K＋通道的关系。

1 材料与方法

1.1 药品与试剂 四氨基吡啶（4－AP）、格列苯脲（Gli）、四乙胺（TEA）均购自Sigma公司，其余试剂为市售分析纯。正常生理盐水溶液PSS：NaCl 144mmol／L，KCl 5.8mmol／L，MgCl21.2 mmol／L，CaCl22.5 mmol／L，葡萄糖11.1 mmol／L，HEPES5。60mmol／L KCl mmol／L：NaCl 89.8mmol／L，KCl 60mmol／L，MgCl21.2mmol／L，CaCl22.5mmol／L，葡萄糖11.1，HEPES 5 mmol／L。

1.2 实验动物 健康雄性Sprague Dawley（SD）大鼠，6周，体质量为200g～250g，由山西医科大学实验动物中心提供，在本动物室喂养2周后方可进行实验。

1.3 实验仪器与设备 离体微血管环张力测定仪DMT（丹麦DMT 公司），PowerLab生物信号采集分析系统及张力换能器（澳大利亚埃德仪器国际贸易有限公司），PHS－3C 精密pH 计（上海雷磁），HW－1000超级恒温水浴锅（成都泰盟科技有限公司），OlympusSZX－1LLB200 解 剖 显 微 镜（日 本），Sartorius BS124S精密天平等。

1.4 大鼠离体冠状动脉环的制备 大鼠断头处死，立即取出心脏置于4℃的PSS中，在体式显微镜下将心脏打开，暴露室壁支，用显微剪将血管周围的组织剔除干净，使冠状动脉游离出来，注意不要牵拉血管。把游离出的冠状动脉剪成2 mm 长的动脉环，放在盛有4℃的PSS的DMT 浴槽中，用钢丝（直径40 μm）固定在DMT 传感器上。

1.5 实验方法

1.5.1 冠状动脉环活性的检测 浴槽内盛有5 mL 正常PSS溶液，持续通以100%氧气，液温维持在37℃。静息60min后，用KCl（60mmol／L）收缩冠状动脉环，静息期间每隔15 min用37 ℃正常的PSS溶液冲洗1次。血管环张力通过DMT 换能系统采集，通过Chart7在计算机上记录。当KCl收缩冠状动脉环的幅度大于1mN，并且相邻两次KCl收缩冠状动脉环的幅度不超过10%时，认为冠状动脉环的活性良好，可以开始正式实验。

1.5.2 细胞外环境pH 值梯度降低对大鼠冠状动脉环张力的影响 在静息状态下，将浴槽内pH7.4的正常PSS液更换为pH7.2的PSS液，待反应达坪台后，将浴槽内的液体依次更换为pH 值为7.0、6.8、6.6的PSS液，观察细胞外偏酸性环境对大鼠冠状动脉环张力的影响。以pH 值为6.6的最大收缩幅度为100%，计算不同pH 值下大鼠冠状动脉环收缩的百分率。

1.5.3 不同浓度KV、KATP、KCa通道阻断剂对细胞外环境pH 值梯度降低时大鼠冠状动脉环张力的影响 在静息状态下，向浴槽内分别加入不同浓度KV、KATP、KCa通道阻断剂：KV 通道阻断剂4－AP（0.3mmol／L、1mmol／L）、KATP通道阻断剂Gli（0.003mmol／L、0.01mmol／L、0.03mmol／L）、KCa通道阻断剂TEA（1mmol／L、3mmol／L），预孵15min，将浴槽内的液体更换为pH7.2的PSS液，待反应达坪台后，将浴槽内的液体依次更换为pH 值为7.0、6.8、6.6的PSS液，分别观察不同浓度4－AP、Gli、TEA 对pH 值梯度降低时大鼠冠状动脉环张力的影响。以药物未干预时pH 值梯度降低引起大鼠冠状动脉环张力的变化为对照组，以对照组pH 值为6.6的最大收缩幅度为100%，分别计算预孵不同浓度4－AP、Gli、TEA 时不同pH 值下大鼠冠状动脉环收缩的百分率。

1.6 统计学处理 应用SPSS19.0分析，用Graphpad Prism6作图。计量资料以均数±标准差表示。采用t检验和重复测量。

2 结 果

2.1 细胞外环境pH 值梯度降低对大鼠冠状动脉环张力的影响 在静息状态下，随细胞外环境pH 值梯度降低，大鼠冠状动脉环的静息张力逐渐增大。以pH 值为6.6的最大收缩幅度为1 00%，pH7.2、pH7.0、pH6.8的最大收缩率分别为（4.51±1.48）%、（42.74±8.32）%、（80.18±5.63）%。

2.2 不同浓度KV 通道阻断剂对细胞外环境pH 值梯度降低时大鼠冠状动脉环张力的影响 KV 通道阻断剂4－AP 对pH值梯度降低引起大鼠冠状动脉环的收缩有抑制作用。4－AP 0.3mmol／L在pH6.6时能减弱大鼠冠状动脉环的收缩幅度，其最大收缩率为（85.85±6.61）%，与对照组相比差异有统计学意义（P＜0.05）；4－AP 1 mmol／L 在pH7.0、pH6.8、pH6.6时均能减弱大鼠冠状动脉环的收缩幅度，其最大收缩率分别为（15.39±9.68）%、（42.06±12.81）%、（55.75±15.66）%，与对照组相比差异均有统计学意义（P ＜0.05）。且在pH6.6时，4－AP 1mmol／L减弱程度比4－AP 0.3mmol／L强，两者相比差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.3 不同浓度KATP通道阻断剂对细胞外环境pH 值梯度降低时大鼠冠状动脉环张力的影响 KATP 通道阻断剂Gli对pH 值梯度降低引起大鼠冠状动脉环收缩的作用呈双向性。Gli 0.003mmol／L在pH6.8、pH6.6时能增强大鼠冠状动脉环的收缩幅度，其最大收缩率分别为（114.12±15.62）%、（120.24±13.78）%，与对照组相比有统计学意义（P ＜0.05）；Gli 0.01 mmol／L在pH6.8、pH6.6时能减弱大鼠冠状动脉环的收缩幅度，其最大收缩率分别为（56.19±3.98）%、（59.07±5.52）%，与对照组相比有统计学意义（P＜0.05）；Gli 0.03 mmol／L 在pH6.8、pH6.6时能减弱大鼠冠状动脉环的收缩幅度，其最大收缩率分别为（46.19±8.64）%、（29.73±6.12）%，与对照组相比有统计学意义（P＜0.05）。且在pH6.6 时，Gli 0.03 mmol／L对大鼠冠状动脉环收缩幅度的减弱程度比Gli 0.01 mmol／L强，两者相比差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.4 不同浓度KCa通道阻断剂对细胞外环境pH 值梯度降低时大鼠冠状动脉环张力的影响 KCa通道阻断剂TEA 对pH值梯度降低引起大鼠冠状动脉环的收缩有增强作用。TEA 1 mmol／L在pH7.0、pH6.8时能增强大鼠冠状动脉环的收缩幅度，其最大收缩率分别为（68.37±17.77）%、（103.2 2±10.27）%，与对照组相比均有统计学意义（P ＜0.05）；TEA 3 mmol／L在pH7.0、pH6.8、pH6.6时能增强大鼠冠状动脉环的收缩幅度，其最大收缩率分别为（64.97±11.79）%、（119.32±17.81）%、（134.77±18.20）%，与对照组相比有统计学意义（P＜0.05）。

3 讨 论

冠心病严重危害人类健康，其发生发展与心肌缺血有着密切的关系［6］。心肌缺血会使心肌细胞发生酸中毒，酸中毒会降低心肌收缩力，加重心肌损伤，使心脏疾病加重［7，8］。

钾通道活性的改变可导致动脉平滑肌细胞膜电位去极化或超极化，并在参与动脉血管舒缩调节中起着重要的作用［9］。本实验着重研究在冠脉调节中起着重要作用，与心脏疾病的发生密切相关的KV、KATP和KCa通道与细胞外酸性环境引起冠脉收缩关系。KV 通道阻断剂4－AP对pH 值梯度降低引起大鼠冠状动脉环收缩的有抑制作用，其抑制作用与pH值和4－AP的浓度有关。pH 值越小，4－AP 浓度越大，抑制作用越明显。KATP通道阻断剂Gli对pH 值梯度降低引起大鼠冠状动脉环收缩的作用有双向性，这种双向性与pH 值和Gli的浓度均有关系。Gli低浓度（0.003 mmol／L）在pH6.8、pH6.6时能增强时大鼠冠状动脉环的收缩，而Gli高浓度（0.01mmol／L和0.03mmol／L）在pH6.8、pH6.6对大鼠冠状动脉环的收缩却有抑制作用。KCa通道阻断剂TEA 对pH 值梯度降低引起大鼠冠状动脉环收缩有增强作用。TEA 浓度越大，对大鼠冠状动脉环收缩的增强作用越明显。本实验说明pH 值梯度降低引起大鼠冠状动脉环的收缩可能与KV 通道开放、KATP通道及KCa通道关闭有关。

本实验仅从肌源学方面探讨了细胞外酸性环境引起大鼠冠状动脉环收缩与KV、KATP和KCa通道的关系，其具体机制研究还有待从电生理学等方面进一步证实。

［1］ De Morais HA，Bach JF，Dibartola SP.Metabolic acid－base disorders in the critical care unit［J］.Vet Clin N AM－Small，2008，38（3）：559－574.

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［3］ Li H，Chai Q，Gutterman DD，et al.Elevated glucose impairs cAMP－mediated dilation by reducing Kv channel activity in rat small coronary smooth muscle cells［J］.Am J Physiol Heart C，2003，285（3）：H1213－H1219.

［4］ Dick GM，Tune JD.Role of potassium channels in coronary vasodilation［J］.Exp Biol Med，2010，235（1）：10－22.

［5］ 吕志杰，张明升，张轩萍，等.pH 值改变对大鼠离体冠状动脉静息张力的影响及机制［J］.中西医结合心脑血管病杂志，2011，9（12）：1474－1476.

［6］ 田新桥.冠心病心肌缺血的应变率与应变成像临床研究［D］.西安：第四军医大学，2005：1.

［7］ Orchard C，Kentish J.Effects of changes of pH on the contractile function of cardiac muscle［J］.Am J Physiol Cell，1990，258（6）：C967－C981.

［8］ 张敏华，刘虹.兔心肌缺血－再灌注损伤冠脉血气变化研究［J］.海军医学高等专科学报，1996，18（1）：9－12.

［9］ Nelson MT，Quayle JM.Physiological roles and properties of potassium channels in arterial smooth muscle［J］.Am J Physiol Cell，1995，268（4）：C799－C822.