拟松材线虫携带的细菌及其致病性研究

林峰，赵博光，王华光

(1．南京林业大学现代分析测试中心，江苏南京 210037;2．南京林业大学森林资源与环境学院，江苏南京 210037;3．南京林业大学机械电子工程学院，江苏南京 210037)

拟松材线虫Bursaphelenchus mucronatus的致病性问题一直存在争议，目前主要存在3种观点:一是认为拟松材线虫不致病或致病力极弱［1－3］，即松树体内存在一定数量的拟松材线虫，也不会对松树的生长产生影响;二是认为拟松材线虫有潜在或有一定的致病力［4－11］，即在松树健康的情况下，拟松材线虫无致病力;当树势衰退或是环境条件恶劣时，将会导致松萎蔫的发生;三是认定拟松材线虫具致病性［12－13］，会导致松树萎蔫。以上研究都是采用林间的实地调查、或将不同来源的野生拟松材线虫人工接种到松属植物，观察病状而得出的结果。其它关于拟松材线虫的研究，则集中在其种下分类、形态、分子鉴定尤其是与松材线虫的区别鉴定等方面［14－16］，这些研究均未对拟松材线虫致病性的根源进行探究。迄今为止，素有松树“癌症”之称的松萎蔫病已经给我国的森林生态系统造成了严重损失，可危害36种松属植物和8种非松属植物［17］。如果拟松材线虫存在潜在的致病性，应尽早引起关注，以免对业已脆弱的松林生态系统造成更大的危害。笔者借鉴了赵博光等［18］研究松材线虫携带的细菌及其致病性的方法，收集了俄罗斯、江西、四川的3个拟松材线虫虫株，从其体表携带的细菌入手，分离并鉴定了不同来源虫株携带的优势细菌种类，并对这些细菌进行了生物毒性测定和室外接种，旨在分析拟松材线虫引起松树不同程度萎蔫的原因。

1 材料与方法

1.1 拟松材线虫及其携带细菌的获得

1.1.1 拟松材线虫的来源 俄罗斯的E2，由俄罗斯国家科学院Dr.O.Klunich提供;四川的样品SC，由四川省森林病虫防治检疫总站陈小平提供，来自四川省泸州县;江西的样品JX2，来自江西省景德镇。

1.1.2 拟松材线虫野外接种与分离 采用贝曼漏斗法分离，挑取50条雌雄成虫放在长满灰葡萄孢Botrytis cinerea的PDA培养基(马铃薯葡萄糖琼脂培养基)上，28℃恒温培养箱中培养5 d之后分离线虫，将拟松材线虫调制成2500条/mL的浓度，对3年生黑松Pinus thunbergii野外接种。每株树接种2 mL，设6个重复。3个月后分离线虫。

1.1.3 拟松材线虫携带细菌的分离 取接种线虫3个月后的木块，70%酒精消毒、去树皮，切成小木块(0.8 cm×0.4 cm×0.1 cm)放入装有NA培养基(牛肉膏蛋白胨培养基)的培养皿中，1～3 d沿线虫爬行的痕迹挑取单一菌落，纯化。

1.2 致病性测定

1.2.1 细菌菌株致病性测定 将1.1.3获得的各细菌菌株活化、离心10 min(4000 r/min)，取上清液用0.22 μm微孔滤膜过滤即得细菌无细胞滤液。将黑松苗(6～8 cm)切根，浸泡在细菌无细胞滤液中，置于26℃恒温箱中，每天光照12 h。逐天观察记录各黑松切根苗的枯萎情况，并将浸泡＜4，4～8，＞8 d的黑松苗达到4级伤害的分成“强致萎活性菌”、“弱致萎活性菌”和“无致萎活性菌”。

1.2.2 细菌菌株的鉴定

1.2.2.1 API自动鉴定系统的鉴定 按照革兰氏染色、氧化酶反应以及过氧化氢酶的测定结果选取不同的试剂条，采用API自动鉴定系统(ATB Expression生物一梅里埃Bio-Merieux公司)鉴定细菌的种类。挑取斜面菌苔，用2 mL的生理盐水制成菌悬液，在ATB浊度计中调整至一定浊度，根据不同的试条要求，加入相应培养基或试剂后，混匀，将一定量的混合液加入试条的各反应孔中，加盖，30℃下培养24 h或48 h，用ATB仪自动检测生长情况，计算机通过ATB Plus等软件分析得到相应结果。

1.2.2.2 分子鉴定 选取5个代表菌株进行16S rDNA PCR扩增和测序。

DNA提取:菌株用NB(营养肉汤)培养至对数生长期，12 000 r/min离心收集菌体，用10 mmol/L Tris-HCl洗涤3次，溶菌酶破壁，蛋白酶处理，再用酚/氯仿/异戊醇抽提，乙醇沉淀，风干，最后溶于TE缓冲液(10 mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH 7.6)中。

16S rDNA的扩增:PCR反应的引物为细菌16S rDNA 全长通用引物，8f，CAC GGA TCC AGA GTT TGA T(C/T)(A/C)TGG CTC AG;和1510r，GTG AAG CTT ACG G(C/T)T ACC TTGTTA CGA CTT。反应液的配置:总体积 50 μL;EX.Taq(5 U/μL)0.25 μL;10 × Ex.Taq buffer 5 μL;MgCl2(25 min)4 μL;Dntp mixture(2.5 mm)4 μL;模版DNA 2.5 ng(0.5 ～5 ng) 约 4 μL;上游引物(50 μm)0.5 μL;下游引物(50 μm)0.5 μL;剩余体积以灭菌双蒸水补足。PCR的反应条件:94℃，5 min;94℃，30 s;50℃，1 min;72℃，1.5 min;72℃，5 min，循环30次，变性、解链、延伸;反应产物经有溴化乙锭的1.2%琼脂糖凝胶电泳检测，其纯化根据胶回收试剂盒(TAKARA公司)的操作说明进行。

16S rDNA克隆及插入子的检测:PCR产物与pMD 18-T载体的连接，以及感受态细胞(大肠杆菌)的制备及转化，按分子克隆常规方法进行。在含有氨苄青霉素(0.5 μg/mL)抗性平板上培养、挑取阳性克隆。阳性克隆再用M13f和M13r引物进行PCR反应，以检测插入子的正确性，反应条件:94℃，5 min;94 ℃，30 s;50 ℃，1 min;72 ℃，1.5 min;72℃，5 min;循环30次，变性、解链、延伸。

PCR产物的RFLP图谱分析:将PCR反应检测获得的阳性克隆产物，用限制性内切酶EcoR I及HindⅢ进行酶切分析。质粒双酶切体系为:EcoRⅠ0.8 μL，Hind Ⅲ 0.8 μL，10 × M buffer 2 μL，质粒5 μL，37 ℃，2 h，加 2 μL loading buffer至管中，混匀终止反应，产物用1.2%琼脂糖电泳检测。

阳性克隆序列分析:每个菌株各挑选1个阳性克隆进行测序分析，登陆NCBI网站(美国国立生物技术中心网站)，使用 BLAST在GenBank，EMBL，DDBJ以及PDB基因库中进行序列同源性比较。所得结果中在相似性最高的几个菌株中比较。

1.2.3 对3年生黑松进行野外接种 将1.1.2获得的线虫与1.1.3分离到的细菌分别配置成不同处理对3年生黑松进行野外接种。处理为:拟松材线虫(Bm)、无菌拟松材线虫(ABm)、ABm+细菌菌株E25混合液、ABm+细菌菌株SC7混合液、细菌菌株E25，SC7菌液。接种方法如下:选择直径为3～5 mm的侧枝，75%酒精擦拭表面，以灭菌剪刀剪去芽和针叶，斜切枝条顶部，迅速插入已剪去底部的塑料离心管，以封口膜包扎。接种量2 mL(线虫液0.5 mL+细菌液1.5 mL)，线虫浓度2500条/mL，细菌液浓度为107cfu/mL。每个处理设6个重复。设NB为对照1(CK1)、生理盐水(0.85%)为对照2(CK2)。接种3个月后分离并记录病状，鉴定分离到的线虫和细菌。

2 结果与分析

2.1 细菌鉴定及其致病性生测结果

2.1.1 细菌的自动化鉴定结果及致病性 由表1、图1可见，拟松材线虫体表分离到的细菌一共28株:其中鲁氏不动杆菌 Acinetobacter 1woffii最多(10株)，占到所有细菌的36%;其次是嗜水气单胞菌Aeromonas hydrophila(4株)、赫氏埃希菌Escherichia hermannii(4株)，其余10个菌株包括耳葡萄球菌Staphylococcus auricularis(3株)、泛菌某些种Pantoeu agglomerans(2株)、铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa(2株)、阴沟肠杆菌Enterobacter cloacae(2株)、荧光假单胞菌Pseudomonas fluorescens(1株)。细菌无细胞滤液对黑松切根苗的生测结果为:强致萎活性菌、弱致萎活性菌、无致萎活性菌分别有10，15，3株。此外，灭菌生理盐水和NB 2种对照对黑松切根苗均无致萎作用，在处理9 d后，松苗把水和NB吸干以后，才慢慢枯萎。

表1 拟松材线虫携带的细菌及其致萎性

图1 拟松材线虫体表细菌种类占比

2.1.2 代表菌株的分子鉴定结果

2.1.2.1 PCR扩增和测序 以强致萎活性菌SC5，SC7，E211和非强致萎活性菌E25，JX23为代表菌株和参比菌株大肠杆菌的基因组 DNA为模板，用细菌16S rRNA基因通用引物进行PCR扩增，扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测。供试的5菌株都得到一条大小约为1500 bp的特异性条带(图2)。图2中1－5编号为:E25鲁氏不动杆菌株1572 bp，E211绿脓假单胞菌株1577 bp，SC5嗜水气单胞菌株1582 bp，SC7荧光假单胞菌株1580 bp，JX23泛菌某些种菌株1584 bp。

图2 细菌16S rDNA PCR扩增后产物电泳图

2.1.2.2 Blast比对结果 SC5，SC7，E211，E25，JX23的16S rDNA序列递交给GeneBank(NCBI)数据库进行BLAST同源序列检索，从结果中选取具有代表性的菌株。比对结果如下:E25鲁氏不动杆菌的基因序列与BLAST显示的100个序列均有98%以上的同源性，与约翰逊不动杆菌Acinetobacter johnsonii最接近。E211铜绿假单胞菌基因序列与BLAST显示的112个序列均有99%以上的同源性，其中除未培养细菌(比例为9%)外，都为假单胞科或假单胞属细菌，其中有26个为恶臭假单胞。因此认为E211菌株是恶臭假单胞Pseudomonas putida，SC5嗜水气单胞菌基因序列与BLAST显示的117个序列均有98%以上的同源性，其中除未培养细菌(占10.3%)外，都为气单胞属细菌，其中有27个为嗜水气单胞菌。因此SC5菌株与机器鉴定结果完全吻合，为嗜水气单胞菌。SC7荧光假单胞菌基因序列与BLAST显示的105个序列有98%以上同源性，其中除未培养细菌外，都为假单胞属细菌，其中有3个为荧光假单胞菌，7个为恶臭假单胞。由于分值最高的两位为荧光假单胞，故认为该菌株与机器鉴定结果完全一致，为荧光假单胞。JX23泛菌某些种基因序列与BLAST显示的90个序列均有96%以上的同源性，其中除了未培养细菌(41.7%)外，有31个欧文氏属 Erwinia，14个泛菌属细菌。分值最高的前10位均为欧文氏属，因而认为该菌株与机器鉴定不相符。菌株JX23是欧文氏菌Erwinia cypripedii。

2.2 3年生黑松野外接种结果 不同接种体接种发病情况有明显差异(表2)，强致萎性细菌SC7单独接种、无菌拟松材线虫、2种对照接种黑松均不发病;野生拟松材线虫SC虫株、无菌拟松材线虫分别与强致萎性细菌SC7混合接种发病严重，3个月内发病率分别达到100%和92%。SC虫株体表分离到的9个细菌菌株中，有5个为强致萎性细菌，因此野生拟松材线虫比无菌拟松材线虫+单独1种强致萎性细菌混合接种发病率更高。无致萎性细菌E25单独接种及其与无菌拟松材线虫混合接种都显现出轻微的病状，发病率分别是14%和17%。接种的拟松材线虫均在3个月后分离到。

表2 不同接种体接种3年生黑松苗的发病情况

3 结论与讨论

(1)细菌分离与鉴定。在细菌分离时，为保证试验的代表性，将同一样品中具有相同菌落形态特征的编为1个号，在一定程度上人为降低了细菌重复出现的几率［19］，同时，为了排除人工培养后线虫沾染杂菌，采用了接种再分离的方法。本试验中，最初每个线虫样品各任意挑取细菌菌株30个，经3次纯化后进行形态观察，从每个虫株上各挑取12个菌株进行机器鉴定，其中8个菌株未能鉴定出结果，而鉴定出的28个细菌菌株具有一定的代表性。此外，为了明确细菌的分类地位，本文还选了5个代表菌株进行了16S rDNA PCR扩增和测序，为后续的生测做准备。

从细菌分离结果来看，拟松材线虫携带的优势菌为鲁氏不动杆菌、嗜水气单胞菌、赫氏埃希菌。从SC和E2虫株分离到的细菌种类可以看出，拟松材线虫体表携带的细菌与地区关系不大。关于拟松材线虫携带的细菌报道较少，贲爱玲［20］从中国拟松材线虫体表分离到食酸丛毛单胞菌Comamonas acidovorans。Tian 等［21］报道了变形菌(Alphaproteobacteria)为拟松材线虫体表的优势菌。可以看出，拟松材线虫体表携带的细菌种类比较复杂，相对于松材线虫，其体表携带的细菌数目少［20，22］。

(2)黑松切根苗生测与室外接种结果。研究松材线虫携带的细菌与松萎蔫病的关系一般多采用无菌苗作为生测材料［23］。高蓉［24］、梁波［25］等对这种生测材料进行了对比并进行了改良，将黑松切根苗作为生测材料。本研究采用梁波［25］的生测方法，对拟松材线虫体上分离到的28个菌株进行了毒性测定。结果表明，同一个拟松材线虫虫株上有可能同时携带强致萎性细菌、弱致萎性细菌及无致萎性细菌。从本文来看，SC虫株携带的强致萎性细菌比例最高，E2虫株次之，而JX2没有携带强致萎性细菌。在强致萎性细菌中，仅包含以下几种细菌(出现频率从高到底):嗜水气单胞菌、鲁氏不动杆菌、恶臭假单胞菌、荧光假单胞菌。而假单胞菌被视为松材线虫体表的主要致病细菌［17，20，26－28］。由此可见，虽然拟松材线虫与松材线虫都携带假单胞菌，但是可能由于前者携带的致病细菌比后者少，因此其致病性在不同地区和不同生态环境下表现不同，尚未对松林造成巨大的损失。

3年生黑松野外接种试验表明，强致萎性细菌单独接种黑松不发病，无菌线虫单独接种也不发病，两者混合接种病情严重，说明拟松材线虫引起的松萎蔫病是线虫与细菌复合侵染的结果。无致萎性细菌E25单独及其与无菌线虫温合接种轻微发病，很可能是在野外接种中无菌线虫感染了致病菌所致［17，29］。Tian［21］证明野生型线虫可以产生比无菌线虫更多的后代，从而推测细菌可以促进拟松材线虫的发育、传播和发展。笔者也曾报道过松材线虫与其携带的某些致病菌会相互促进繁殖［30－31］，松材线虫与其携带的致病菌是长期进化过程中形成的互惠共生关系，而与弱致病菌及无致病菌不能相互促进繁殖，这一结果解释了为什么松材线虫在一些地区发病严重，而在另一些地区并不发病这一现象。

本文首次系统地分离了几种来源的拟松材线虫体表携带的细菌，生测了其致病性，指出拟松材线虫引起的松萎蔫病是线虫与细菌复合侵染的结果，为该病在防治上提供了病理学基础。

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