单纯疱疹病毒性角膜炎的发病机制

吴甦潜 徐建江

单纯疱疹病毒性角膜炎(herpes simplex keratitis，HSK)是当今最严重的角膜感染性疾病之一，在美国的发病率约为11.8/105［1］。目前已知可致HSK的病原体为单纯疱疹病毒-1型(herpes simplex virus-1，HSV-1)与单纯疱疹病毒 -2型(herpes simplex virus-2，HSV-2)，其发病机制至今尚未完全明晰。现今对其发病机制的研究大多以小鼠及家兔为对象的研究，但两者发病时的严重程度均与人类有不少差别。

1 HSV-1

HSV-1引起的HSK占主要部分，为国内外最常见的致盲眼病之一。其发病机制与病毒的侵入、转移、潜伏、复发等环节有关，同时与人体的免疫应答相关。

1.1 初次感染与入侵 HSV-1一般通过直接接触进入宿主黏膜组织，其最具可能的储存宿主是口腔，此后病毒进入感觉神经末梢，从而侵入神经系统;此外HSV-1也可通过飞沫传播接触眼表结构或通过角膜移植造成感染。HSV-1进入角膜的过程由粘连蛋白-1(nectin-1)、疱疹病毒侵入载体(herpes virus entry mediator，HVEM)以及配对免疫球蛋白样2型受体-α(paired immunoglobulin-like type 2 receptor-alpha，PILR-α)介导［2］。HSV-1对角膜的易感性与HSV-1株的来源及其被感染者基因构成［3］、免疫应答、泪膜结构与功能的完整性［4］有关。

HSV-1进入细胞后，通过病毒宿主关闭(virion host shutoff，VHS)蛋白降解宿主细胞内的信使 RNA(messenger RNA，mRNA)，从而关闭其原有的蛋白质合成过程。此后HSV-1的DNA被释放进入细胞核。根据HSV-1裂解基因表达时段的不同，通常将其DNA上的基因及其最后合成的蛋白分作3期:极早期(immediate early，IE)、早期(early，E)和晚期(late，L)。其中感染细胞蛋白0(infected cell protein 0，ICP0)是极早期主要的调节蛋白，它可通过与染色质重塑酶的相互作用激发病毒的转录和复制;通过阻止组蛋白去乙酰化(histone deacetylation，HDAC)从而刺激基因表达［5］。ICP4能够上调早期基因、晚期基因表达，从而延续病毒复制;同时抑制潜伏相关转录子(latency-associated transcript，LAT)的表达，避免病毒提前进入潜伏状态［3］。HSV-1初次感染角膜时，其快速、有效的复制能力一定程度上帮助延长了HSK的病程，并为之后的潜伏和复发做了准备。HSV-1初次感染中，温和的自然免疫为主要应答机制，因此多数HSK的初发患者鲜有明显症状;但若缺少获得性免疫，仍无法清除病毒［4］。HSV-1的 DNA 及其传感器 IFI-16［6］通过树突细胞(dendritic cell，DC)上的Toll样受体(Toll like receptor，TLR)识别(通常为 TLR3，7，9)［4］后激活 DC。Frank等［7］发现被激活后的DC能够释放或上调一系列多种功能的趋化因子和细胞因子，从而引起自然杀伤(natural killer，NK)细胞及炎症单核细胞聚集至角膜并进行病毒清除。NK细胞的聚集很可能与趋化因子CXCL9，10和自身表面的受体CXCR3相互作用有关［8］。DC也能释放1型干扰素参与控制HSV-1的复制［9］。近期Kim等［10］发现，除了DC之外，NK细胞及广泛存在于角膜的CD11b+肥大细胞也会通过TLR2识别与HSV-1有关的病原体相关分子模型(pathogen-associated molecular pattern，PAMPs)或通过暴露于 γ 干扰素(interferon γ，IFN-γ)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)从而被激活。

1.2 潜伏与再活化 HSV有存在于宿主特定部位同时不进行蛋白合成——即潜伏的能力，HSK也随即进入潜伏期。HSV-1在神经系统最常见的潜伏部位是三叉神经节，此外还有脊髓、膝状体、前庭神经、迷走神经的神经节以及睫状神经节等部位［3］。有研究［11］表明HSV-1在三叉神经节的潜伏与宿主的年龄、性别无关。目前HSV-1潜伏的机制为病毒、神经元、CD8+T细胞三者互相作用的过程。整个过程大体可分建立潜伏、维持潜伏、再活化3个阶段［12］。Bloom 等［13］近期发现 HSV-1在感染或转运时就开始建立潜伏。当HSV-1内除LAT外其他转录都停止后，潜伏建立完成［3，12］。LAT与HSV-1的潜伏及在神经细胞内的生存息息相关，其作用尚未被完全了解，但很可能是通过下调IE、E、L基因的表达，抑制病毒在神经元内的复制，增加HSV-DNA的数目，抑制HSV-1凋亡［14］等途径达到。HSV在潜伏的维持期不合成新的蛋白，因而难以被免疫系统识别，因此患者处于潜伏期时几乎无任何症状。近年来针对HSK相关微小RNA(micro RNA，miRNA)的研究解释了部分HSV-1的潜伏机制。Umbach等［15］通过体外实验发现，LAT是4种miRNA的前体。其中一种miRNA(miR-H2-3p)在神经节内能够抑制ICP0表达，从而阻止其调控HSV-1的DNA复制;另一种未知来源的miRNA(miR-H6)则能够抑制ICP4的表达。之后Kramer等［16］通过小鼠实验发现，上述miRNA对于潜伏的维持并非必须，而可能是潜伏的促发因素。

HSV-1在三叉神经节内复制并建立潜伏时相应的免疫应答，同样以自然免疫为主:CXCL10和CCL2通过TLR-9信号通路引起肥大细胞和δT细胞在神经节浸润［4］;肥大细胞产生的IL-12诱导γδT细胞产生并释放IFN-γ。鼠类研究发现，受感染的神经节周围有CD8+T细胞包绕，这些细胞能够通过以下2种途径阻止HSV-1再活化:一种是合成并释放 IFN-γ阻止HSV-1基因表达;另一种是释放裂解颗粒进入受感染的神经元，进而阻止 HSV-1再活化。进入细胞的裂解颗粒并非如CD8+T细胞通常的杀伤机制那样，诱导神经元凋亡从而杀灭神经元。这可能与LATs抑制HSV-1凋亡的作用有关［17］。Reddy等［18］发现HSV-1在三叉神经节内的潜伏时间以及再活化的时机与CD8+T细胞表面的受体Tim-3及其配体Gal9的相互作用有关;观察发现缺乏两者相互作用时，病毒的潜伏时间有所延长。此外，临床研究［19］发现HSV-1潜伏在人体内的三叉神经节周围有CD8+T细胞和CD4+T细胞包绕。这些T细胞可能与复发后引起的特异性获得性免疫应答有关。

尽管有很多报道指出，人们总是能够在不同时段从被感染者的角膜中，检测到病毒蛋白很低的HSV-1，但角膜是否是HSV-1潜伏的场所一直饱受争议。争论的关键在于HSV-1究竟是以潜伏的形式存在于角膜中，还是仅仅作为感染或转移途中经过的场所［20］。Polcicova等［21］曾构造一个能够在角膜里复制，然后转运出去，但不能从感觉神经节回到角膜的HSV突变体。鼠类研究的结果显示宿主的角膜炎严重度与对照组并无显著区别，提示HSK也可能由一直潜伏或持续存在于角膜的病毒所引起。

HSV-1的再活化可以自然产生，也可以由某些因素诱发。有研究［22］提出HSV-1的再活化包括2个步骤:①裂解基因的去抑制;②病毒全基因的表达。后者可通过病毒蛋白16(viral protein 16，VP16)加强。HSV-1的再活化和ICP0再次高表达有关［23］。目前已知能够诱发人体内的HSV-1再活化的环境因素有发热、风、暴晒、创伤以及三叉神经节相关的外科措施等［3］。除此之外，白介素(interleukin，IL)-6、睫状神经营养因子(ciliary neurotrophic factor，CNTF)及胸苷激酶(thymidine kinase，TK)能够刺激HSV-1再活化;而LAT和神经生长因子(nerve growth factor，NGF)能够抑制HSV-1的再活化。

1.3 复发与再次感染 再活化的HSV-1和HSV-2在角膜所诱发的免疫应答迅速而频繁;虽然其中大多次数的免疫应答不会引起明显的临床症状，但再活化的HSV还是可以导致HSK的复发。角膜及其附近感觉神经分布较为密集，因而角膜是HSV-1相关疾病复发最频繁的场所之一。由于复发引起的免疫应答属于获得性免疫应答，因此HSK开始复发的过程较为短暂，并且能够导致角膜基质层不可逆的损伤，造成严重且反复发作的临床症状，包括角膜混浊、新生血管形成等，甚至导致失明。能够增加HSK复发风险的因素，有先前的基质型角膜炎史;而与年龄、性别、种族、季节、心理因素，甚至上皮型角膜炎和非眼部的HSV-1感染史都无关。还有学者［3］认为，与HSK复发有关的因素，包括免疫应答状态以及病毒和宿主双方的基因构成。此外有研究［24］表明IFN-λ的低表达可能与HSK复发有关。

HSK的复发除了因HSV-1的再活化外，还可能由于不同来源的HSV-1在相同部位的再次感染。穿透性角膜移植术(penetrating keratoplasty，PKP)可能是再次感染的危险因素;此外HSV-1对治疗药物(多为阿昔洛韦)产生耐药［25］也可能是引发HSV-1再次感染的原因之一。

角膜新生血管(corneal vascularation，CV)是HSK的一大特征性临床表现，尤其见于复发的角膜基质型HSK，常在复发1 d后就开始发生。正常的角膜能够保持无血管的特性部分依靠其携带的可溶性血管内皮生长因子受体-1(soluble vascular endothelial growth factor-1，sVEGF-1)与血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)结合，抑制新生血管形成［26］。HSV-1侵犯角膜后，中性粒细胞迅速浸润，由此产生金属蛋白酶9(matrix metalloproteinase 9，MMP-9)，从而使得sVEGF-1数量减少［27］。此后，多由VEGF-1与VEGFR-2结合使得新生血管形成［27］，VEGF-3和4与VEGFR-3结合使得新生淋巴管形成［28］。其中VEGF可能是由被感染后的细胞产生IL-6以及TLR-9被激活后驱使相邻的正常细胞产生。近期Suryawanshi等［27］发现γδT细胞产生的IL-17A也能驱使相邻的正常细胞产生VEGF-1。HSV-1相关抗原通过新生成的淋巴管进入附近的淋巴结，激活T细胞和B细胞;被激活的T细胞通过新生成的小血管进入角膜［4］。由于CV缺乏独立的内皮细胞和周细胞，因而炎症细胞很容易侵入角膜基质，引起视功能不全。

近期研究发现，CV的形成也受一些miRNA控制。其中miR-132可能由早期CV相关免疫反应时分泌的IL-17所刺激产生，它可抑制Ras-GAP蛋白的表达，而Ras-GAP对于VEGF的功能有负调控作用。因此miR-132能够促进VEGF信号通路，推进 CV 进程［29］。

因强烈的获得性免疫应答所致的角膜基质损伤是导致视觉障碍和失明的主要原因。它主要由辅助T(helper T，Th)1细胞、Th17细胞及中性粒细胞间的相互作用而引发。Th1细胞首先进入角膜基质，通过CCL20介导Th17细胞的趋化作用。中性粒细胞则是释放氧自由基等组织损伤因子的主要来源。Suryawanshi等［30］通过小鼠实验发现Th17细胞释放的IL-17在角膜损伤中存在关键作用，可能是促进中性粒细胞趋化和释放组织损伤因子的因素。当敲除IL-17的受体后，角膜损伤程度大大减轻。

近期研究发现 HSK所致角膜损伤也受 miRNA调控。Mulik等［31］通过动物实验发现敲除miR-155后，感染HSK的个体的角膜损伤显著减轻。miR-155的作用可能在于促进CXCL1等中性粒细胞趋化因子的释放以及抑制IL-10等抗炎因子的产生。

2 HSV-2

HSV-2引起的HSK发病率虽低于HSV-1，但由于HSV-2可通过性传播及母婴传播，因而能够引起新生儿HSV感染性疾病。调查［32］显示13% ～20%感染HSV的新生儿有眼部感染的表现。而对于婴幼儿而言，HSV-2比HSV-1更具神经毒性。此外，由于HSV-2的感染与人类免疫缺陷病毒的传播密切相关，因而HSV-2感染性疾病又被归为一种性传播疾病。

HSV-2的感染及宿主应答的机制与HSV-1极为相似，同样分为病毒的侵入、转移、潜伏、复发等环节。和HSV-1类似，HSV-2也可以直接侵犯进入角膜，这一过程可能由HVEM介导。关于HSV-2的潜伏，Richter等［33］在36具生前感染史不详的尸体头颈部采集了神经节，他们对包括三叉神经节在内的8类神经节进行了HSV-1、HSV-2、水痘-带状疱疹病毒(varicellazoster virus，VZV)筛查，结果没有发现一处显示HSV-2阳性。HSV-2能否潜伏于三叉神经节仍然没有结论;相比之下，脊神经节是公认的HSV-2最常潜伏的神经节［34］。另外有研究［35］发现HSV-1与HSV-2通常潜伏于不同的神经节亚群，这可能与两者LAT位置与序列的差异有关。

3 结语

HSK的发病机制，本质上是HSV的毒力、侵袭力与宿主机体免疫力“角力”的过程;其中包含大量复杂的环节，涉及多类细胞和分子。近年来，HSK的发病机制有了诸多研究进展，尤其是近期对于TLR和miRNA的广泛研究，使得HSV引发的自然和获得性免疫应答机制及其调控因素有了进一步的认识。与此同时，HSV与宿主的关系以及两者“角力”的机制，仍然需要更完整的认识，尤其在分子免疫应答、病毒分子结构等方面仍需要深入探究［4］。这样才可在临床治疗中，做到既能抑制HSV的复制和毒性，又能阻止过强的免疫反应造成角膜损伤，从而达到两者的平衡点。

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