导流杂交基因芯片技术在成人喉乳头瘤病毒感染分型检测中的临床应用△

郭敛容 苏永进 王芬 蔡智 林宜玲

人乳头瘤病毒(human papilloma virus，HPV)可致人类皮肤和黏膜异常增生，引起多种良、恶性病变［1］。HPV感染与疾病的相关性在近年国内外刊物中均有报道，尤其是HPV感染在尖锐湿疣、宫颈癌中研究较多，但在喉乳头瘤中报道较少。目前临床上公认的HPV检测方法当属第二代杂交捕获(hybrid captureⅡ，HC-Ⅱ)技术［2］，但其缺点是不能具体对 HPV基因型分型，不能判断多重感染。导流杂交基因芯片技术(flow-through hybridization and gene chip)，即凯普导流杂交HPV DNA检测法(简称HybriMax)［3］是 HPV基因型分型检测的新方法。本文对36例喉乳头瘤患者、30例声带息肉患者的标本及20例宫颈细胞标本进行了导流杂交基因芯片技术HPV检测，报告如下。

1 资料与方法

1.1 资料 2010年3月～2012年10月本院收治的喉乳头瘤患者36例，年龄25～64岁，平均36.4岁;声带息肉患者30例，年龄23～60岁，平均33.5岁。取支撑喉镜下手术切除部分标本，置于液氮中，-76℃保存。所有患者经最后病理确诊。取本院妇科门诊宫颈细胞标本 HC-Ⅱ检测阴/阳性各10份，同时留取行HybriMax技术检测标本1份，标本置于-76℃保存。所有标本采集和诊治过程均经就诊者本人同意。

主要试剂包括基因组DNA提取试剂盒(离心柱型)(凯普公司)、HPV分型检测试剂盒(凯普公司)、HybriMax医用核酸分子快速杂交仪(HHM-2)(凯普公司)及HC-II试剂盒。

1.2 方法

1.2.1 HPV分型检测 采用 HybriMax技术检测HPV 6、11、16、18、31、33、35、39、42、43、44、45、51、52、53、56、58、59、66、68、81 型共 21 种亚型。基本原理是先将病毒基因的DNA进行基因扩增，然后利用核酸分子快速导流杂交技术法，使目的分子导流穿过固定有DNA探针的低密度基因芯片薄膜上而发生快速杂交。实验步骤:样本 HPV DNA提取，聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)扩增，核酸分子快速导流杂交，结果判读，按芯片上HPV亚型分布的相应着色位点判断。有两型或以上属多型感染。具体如下:①DNA提取。组织悬浮在200 μL溶液P和40 μL蛋白酶K中，震荡混匀;56℃孵育过夜;加入200 μL溶液L，75℃温浴10 min;将液体转入带硅胶柱的2 mL离心管中，通过数次离心，最后加入100 μL的TE洗脱液，弃柱得DNA。②HPV-DNA的扩增。按照试剂盒说明书扩增程序进行PCR扩增反应。

1.2.2 导流杂交法检测HPV基因分型 20 μL生物素标记的PCR产物经过变性，与500 μL预热至45℃的杂交缓冲液混合，在导流杂交仪HybriMax上45℃孵育15 min，然后进行导流杂交。杂交后，再用0.8 mL杂交缓冲液冲洗3次。在25℃条件下，用封阻液封阻孵育 5 min。封阻后，加入 0.5 mL酶标液，孵育3.5 min。用冲洗缓冲液A冲洗杂交膜，去除未结合的酶标液，显色过程加入0.5 mL NBT/BCIP底物，在36℃保持3～5 min或直至显色完成。在显色后1 h内查看结果。

1.2.3 HC-Ⅱ法检测 HPV HC-Ⅱ法检测 HPV基因型:操作步骤及结果判定严格按照试剂盒说明书进行。

1.3 统计学处理 采用SPSS 16.0软件，HybriMax检测方法与HC-II法检测结果符合情况采用一致性检验，计算灵敏度与特异度。不同组别HPV阳性率差异采用χ2检验。

2 结果

2.1 HPV感染型别分布 36例喉乳头瘤病变样本中18例HPV亚型被检出，HPV阳性率50%(18/36)，检出的 HPV亚型有 2种，依次为HPV 6型(33.33%、12/36)、11 型(16.67%、6/36)。HybriMax 技术检测全部30例声带息肉标本，均未检出HPV。χ2检验统计分析两者阳性率，差异有统计学意义(P＜0.01)。

2.2 HybriMax技术与HC-Ⅱ法检测的一致性分析HC-Ⅱ法检测HPV阳性的宫颈细胞标本，HybriMax技术均检出HPV，亚型分别为52、59、68型，其中52型50%(5/10)、58 型 30%(3/10)、59 型 20%(2/10)。HC-Ⅱ法检测HPV阴性的宫颈细胞标本，HybriMax技术检测1例为HPV阳性，亚型为53型，其余标本均为阴性。敏感度为100%，特异度为90%。

3 讨论

HPV是一组病毒的总称，根据DNA限制性内切酶核壳体蛋白质的抗原性不同，目前已经确定的亚型最少有70种［4］。HPV根据其致癌的危险性分为高危型、低危型及中间型。低危型包括 HPV6、11、13、32等，可引起皮肤、黏膜良性病变;高危型常在癌变组织中检出，主要有 HPV16、18、45、52、56 型等;中间型有HPV 31、33、35型等，在良、恶性组织中均能检出，但不是主要型别［5］。目前HPV与宫颈病变的关系研究较多，且已明确高危型HPV的持续感染是宫颈癌的病因。对HPV感染的检测和分型是处理宫颈病变的重要依据。临床上可观察到以下现象:成人喉乳头瘤存在一定恶变率，儿童喉乳头瘤易复发。普遍认为存在上述现象的原因在于:喉乳头瘤的发病与HPV感染有关;不同组病例感染亚型不同，导致不同的转归［6］。随着技术的发展，病毒基因分型新方法的出现使得HPV分型成为可能。早在1995年就有学者采用多重PCR和原位杂交技术检测成人喉乳头瘤中HPV感染情况，阳性率为16.67%［7］。PCR检测方法的成熟，使得临床可以检测常见的 HPV 6、11、16、18等分型。有文献［8］报道喉乳头瘤中HPV检出率在33.3%左右。有学者用更为先进的荧光定量PCR(FQ-PCR)检测儿童喉乳头瘤组织HPV DNA，结果显示 HPV6型和HPV11型病毒的检出率为88.46%［9］。原位杂交技术和PCR检测方法只能检测少量亚型，且操作较复杂，不能大规模地适用于临床检验，限制了其临床研究发展。

目前国际上常用的HC-Ⅱ技术，是迄今为止唯一获得美国食品与药品管理局认证用于临床的HPV检测手段，已广泛应用于临床，但其缺点是不能检测HPV基因型具体分型，高危型和低危型不能同时检测，不能判断多重感染。而HybriMax能同时对21种HPV基因型进行分型检测，是目前针对HPV最先进的检测方法。该技术在宫颈癌中已得到印证与推广［10-11］，但尚无文献报道其应用于喉乳头瘤的检测。本次实验结果显示，10例应用HC-Ⅱ技术检测阳性的宫颈细胞标本 HybriMiax技术均检出 HPV，表明HybrMiax技术敏感度高，与HC-Ⅱ技术检测结果一致性良好，且能对更多基因型确切分型。HC-Ⅱ法检测HPV阴性标本，应用HybriMax技术检测HPV 1例为阳性，亚型为53型，可能因为HybriMax技术除了能检测HC-Ⅱ法包含的HPV亚型外，还能检测HPV66、53、81亚型。此外，HC-Ⅱ每次检测的标本量大，更适合于大规模筛查。HybriMax法每次检测的样本量可根据实际情况在1～15个之间调整，更灵活。以上表明，HybriMax法应用于喉乳头瘤中HPV检测显示出明显优越性，是值得在临床推广的新方法［12］。

对喉乳头瘤的发病机制，多数学者认为与HPV相关［13］。HPV感染在喉部主要引起喉乳头瘤，多由HPV6、11型引起，而HPV在喉癌发病机制中的作用尚不明确［14-15］。有文献［16］报道，HPV6、11 型与喉乳头瘤相关，HPV16、18型多在疣状癌及喉癌中表达。本次实验采用HybriMiax技术检测出HPV基因型2种，分别为HPV 6型和11型，与文献报道相符。HPV6、11型属于常见低危基因型，该型易引发呼吸道乳头瘤［17］，其检出率与文献［18］报道相符。另外有研究［19］表明，HPV6和HPV11型感染可能与小儿复发性喉乳头瘤密切相关。本研究在成人喉乳头瘤患者HPV检出率为50%，说明HPV可能在喉乳头瘤发病中起一定作用，但并非唯一原因。成人喉乳头瘤、儿童喉乳头瘤以及喉癌中HPV的表达、基因型的区别也需进一步研究，这将在本课题的后续研究中得以实现。

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