牦牛酸 乳分离发酵乳杆菌发酵豆浆的胃溃疡预防效果研究

赵 欣，骞 宇

牦牛酸 乳分离发酵乳杆菌发酵豆浆的胃溃疡预防效果研究

赵 欣，骞 宇*

（重庆第二师范学院生物与化学工程系，重庆 400067 ）

以采自川西青藏高原的自然发 酵牦牛酸乳样 品中分离纯化得到的1株发酵乳杆菌（Lactobacillus fermentum Zhao，LFZ）作为研究对象，探索比较其与商业用嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus，ST）发酵豆浆的胃溃疡预防效果。通过利血平诱导胃溃疡小鼠模型，LFZ组小鼠的IL-6、IL-12、TNF-α和IFN-γ细胞因子低于ST组小鼠；血清生长抑素和血管活性肠肽水平高于ST组，胃动素和P物质水平低于ST组，且LFZ组小鼠胃溃疡面积也低于ST组小鼠。由此可知，Lactobacillus fermentum Zhao发酵豆浆的品质优于标准嗜热链球菌发酵豆浆，且其对胃溃疡有很好的预防效果。

豆浆；乳酸菌；氨基酸态氮；大豆异黄酮；胃溃疡

青藏高原自然发酵牦牛酸乳是藏区的一种极具地方特色的传统发酵乳制品，具有丰富的营养、独特的风味和抗氧化、降低胆固醇、调节机体免疫能力等保健功能，受到了越来越多的关注[1]。研究发现牦牛酸乳的保健功能很可能与其中丰富的乳酸菌菌群有极大关系，而牦牛酸乳中的乳酸菌群种类主要受各地区牧民生活习惯、挤奶及发酵的器具、发酵温度、时间等因素的影响，故从牧区的牦牛酸乳分离出的乳酸菌与常用的商业乳酸菌有很大区别[2]。

目前因为大量的研究表明[3-5]，乳酸菌具有抑菌、增强机体免疫力、抗衰老和抗癌等生理功能，现已被广泛应用在食品发酵工业，但我国工业中生产发酵乳制品所用的绝大部分乳酸菌均来自于国外，因此国内学者已经开始对青海、西藏和甘肃等地区牦牛发酵乳中含有的微生物进行了分离、鉴定，旨在发现具有我国自主知识产权的、保健功能显著的乳酸菌[6-7]。

研究表明，豆浆经过发酵后，大豆中的大分子被分解成更易被人体吸收的小分子化合物，部分抗营养因子也被分解，使大豆中的营养能被人体充分利用，从而体现出比新鲜豆浆更高的营养价值[8]。因为发酵微生物中的蛋白酶使大豆中的蛋白质部分水解，使得低分子质量的多肽、游离氨基酸含量大大增加，易于肠黏膜的吸收，提高了人体对豆浆的消化吸收率，并具有一定的保健功能，对于减轻胃溃疡患者胃部负担有很好的帮助。同时发酵豆浆中的乳酸菌能调节肠道功能正常活动[9]。

本实验选用来自四川阿坝藏族羌族自治州的红原县牧民家庭的自然发酵牦牛酸乳中分离鉴定的一株发酵乳杆菌（Lactobacillus fermentum Zhao，LFZ）为对象，同时选取酸乳制造工业上常用的嗜热链球菌作为对照菌株，这两种菌均为革兰氏阳性菌，且都是酸乳制品中存在的重要菌株。利用两种菌种生产发酵豆浆，初步分析两种菌发酵豆浆的理化特性和预防胃溃疡的保健功效，为将牦牛酸乳中分离到的保健功能显著的乳酸菌运用到食品发酵工业生产和利用优质乳酸菌生产高品质保健豆浆提供实验数据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

商用嗜热链球菌购自中国工业微生物菌种保藏管理中心；乳酸菌分离自四川阿坝藏族羌族自治州的红原县自然发酵牦牛酸乳中分离鉴定的一株发酵乳杆菌，命名为Lactobacillus fermentum Zhao（LFZ），中国典型培养物保藏中心编号CCTCC M2013513。

发酵豆浆选用黑龙江农垦总局2012年产优质黄豆用凉水浸泡12 h打浆后用纱布过滤后得发酵前豆浆原汁，然后按105个/mL分别接种牦牛酸乳中分离的乳酸菌与商业用嗜热链球菌在37 ℃条件下发酵12 h，得到发酵豆浆。

甲醇（色谱纯）、无水乙醇（分析纯）、甲醛（分析纯） 重庆市品誉化工有限公司；MRS培养基 上海艾研生物科技有限公司；大豆黄素、染料木素和利血平美国Sigma公司；胃动素（motillin，MOT）、生长抑素（somatostatin，SS）、P物质（substance P，SP）和血管活性肠肽（vasoactive intestinal peptide，VIP）血清因子试剂盒 北京普尔伟业生物科技有限公司；细胞因子IL-6、IL-12、TNF-α、IFN-γ试剂盒 美国Biolegend公司。

1.2 仪器与设备

Waters 2487型高效液相色谱仪 美国Waters公司；UV-1750型紫外分光光度计 日本岛津公司。

1.3 方法

1.3.1 乳酸菌耐受人工胃液的测定

将氯化钠（0.2 g/100 mL）和胃蛋白酶（0.35 g/100 mL）溶解后用1 mol/L的盐酸后调节pH值到3.0配制成人工胃液，灭菌后备用。将菌株培养液3 000 r/min离心10 min后收集菌体，再加入灭菌生理盐水配制成为106个/mL的菌悬液，取配制好的菌悬液与的人工胃液按1∶9比例混合，摇匀后置于恒温培养箱中37 ℃培养3 h，取培养后的菌液1 mL均匀涂抹在MRS琼脂培养基上37 ℃培养48 h[10]。用平板计数法测定活菌数，按公式（1）计算其存活率。

1.3.2 乳酸菌耐受胆盐的测定

将菌种5 mL按2%的接种量分别接种于含0.0、l.0 g/100 mL的牛胆汁粉（oxgall）的MRS-THIO培养基（MRS培养基中加0.2 g/100 mL的巯基乙酸钠），在恒温培养箱中37 ℃培养24 h后，以空白培养基（未接种的MRSTHIO培养基）为对照，分别测定上述不同质量浓度培养基的OD600nm值[10]，按照公式（2）计算菌株对胆盐的耐受力。

1.3.3 活性异黄酮含量的测定

采用高效液相色谱法分别将大豆黄素和金雀异黄素标准品用80%乙醇溶解，配制成质量浓度为0.002～0.020 g/L的标准溶液。取标准溶液20 μL注入六通阀中，用高效液相色谱仪测定峰面积。求得回归方程为Y大豆黄素=148 338+1.70×108X（R2=0.999）；Y金雀异黄素= -316 706+4.20×108X（R2=0.995），式中Y为异黄酮含量，X为峰面积，由此得到标准曲线。分别在发酵6、12 h时吸取2 种发酵豆浆样品各100 mL，4 000 r/min离心得到上清，在80 ℃烘箱中干燥。干燥物用200 mL的80%乙醇80 ℃恒温水浴中回流提取2 h，回流提取两次。合并提取液减压蒸干，用无水乙醇定容10 mL作为待测液，根据标准曲线得到质量浓度。

1.3.4 昆明小鼠诱导胃溃疡实验

SPF级昆明小鼠50 只，雄性，体质量20～25 g，适应基础饲料1 周后，按照体质量将大鼠随机分为5 组，分别为：正常组、胃溃疡对照组、牦牛酸乳分离乳酸菌发酵豆浆组（LFZ组）、商业用嗜热链球菌发酵豆浆组（ST组）和雷尼替丁组（阳性对照组），每组10 只，在相对湿度（50±10）%，室温保持（24±2） ℃，12 h明暗轮换（8：00—20：00照明）条件下饲养。实验期间，正常组和胃溃疡对照组小鼠每日灌胃0.2 mL生理盐水，LFZ组和ST组小鼠每日灌胃0.2 mL对应的发酵豆浆，雷尼替丁阳性对照组每日按50 mg/kg灌胃0.2 mL雷尼替丁稀释液，在实验过程中，未出现小鼠对灌胃物质不适出现死亡的情况。实验期间各组小鼠自由摄食和饮水，实验期4 周。4 周后，除正常组小鼠外，其余4 组小鼠均实施腹腔皮下注射0.2 mL利血平悬浊液（10 mg/kg）。注射24 h后，将5 组小鼠全部处死解剖，摘取小鼠全胃，浸泡入福尔马林中，10 min后用数码相机拍照，并使用ImageJ软件分析胃溃疡面积，计算胃溃疡指数。

1.3.5 小鼠血清因子水平的测定

脱颈椎处死小鼠，取小鼠动脉血浆0.2 mL，在4 ℃、3 000 r/min离心10 min，取上层血清。按测试剂盒说明书的方法测定胃动素（MOL）、生长抑素（SS）、P物质（SP）和血管活性肠肽（VIP）因子在血清中的水平。

1.3.6 酶联免疫法测定血清中细胞因子水平

脱颈椎处死小鼠，取小鼠动脉血浆0.2 mL，在4 ℃、3 000 r/min离心10 min，取上层血清。采用定量酶联检测试剂盒，按酶联免疫法用紫外分光光度计，在450 nm波长处检测血清中细胞因子IL-6、IL-12、TNF-α和IFN-γ水平。

1.4 数据分析

使用SAS统计软件对所得到重复3 次实验的数据采用One-Way ANOVA法分析各组数据结果之间是否存在统计学差异（P＜0.05）。

2 结果与分析

量。由图1可知，在最初发酵的6 h两菌种发酵豆浆中的大豆黄素和金雀异黄素质量浓度的增加较为迅速，6 h后含量基本没有增加，整个发酵过程中牦牛酸乳中分离的LFZ发酵豆浆的大豆黄素和金雀异黄素质量浓度均高于商业嗜热链球菌发酵豆浆。大豆异黄酮具有降低胆固醇、预防心血管疾病和癌症的作用，其中大豆黄素和金雀异黄素属于大豆异黄酮中游离型苷元类型，可以直接被人体吸收利用，是大豆异黄酮中最主要的功能性成分类型[13]。本实验中牦牛酸乳中分离的LFZ菌发酵豆浆具有较高的游离型苷元大豆异黄酮，其功能性成分质量浓度高于商业嗜热链球菌发酵豆浆。

图1 不同菌种发酵豆浆的大豆异黄酮含量Fig.1 The contents of isoflavones in soybean milk fermented by different strains

2.1 不同菌种耐胃酸、胆盐能力的比较

表1 乳酸菌耐胃酸、耐胆盐的能力测定结果Table 1 Resistance of lactic acid bacteria to gastric acid and bile salt

由表1可知，牦牛酸乳分离出的LFZ乳酸菌能很明显地耐受pH 3.0的环境，存活率达到84.33%，远高于嗜热链球菌5.63%的存活率。乳酸菌作为益生菌经过胃部存活的菌体进入小肠后将与胆盐接触，所以把乳酸菌对胆盐的抵抗能力作为判断益生菌活力的一个标准[11]。LFZ乳酸菌对不同质量浓度胆盐有一定的耐受力，随着胆盐质量浓度的增加生长率略微下降，在不同质量浓度下的生长率也明显高于嗜热链球菌。酸乳菌发酵产品中的乳酸菌活菌进入人体后对人体胃液和胆盐的抵受能力越强，其在肠道内定殖能力就越强，对人体起到的功效，特别是对人体胃肠道起到的功能性作用就越好[12]。

2.2 不同菌种发酵豆浆的大豆异黄酮含量

样品处理后，使用高效液相色谱仪进行测定，对照标准曲线得到待测样品中大豆黄素和金雀异黄素的含

2.3 不同菌种发酵豆浆对小鼠胃溃疡指数的影响

图2 不同菌种发酵豆浆对小鼠胃溃疡的观察Fig.2 Effect of soybean milk fermented by different strains on gastric ulcer in mice

对灌胃发酵豆浆的小鼠用利血平诱导胃溃疡后观察小鼠胃部溃疡程度，由图2可知，对照组的溃疡最为严重，溃疡面积达到（6.58±1.77）mm2，灌食LFZ发酵豆浆和ST发酵豆浆的小鼠胃溃疡面积分别下降到（2.41±1.13）mm2和（3.84±1.55）mm2，通过计算可得知LFZ发酵豆浆组的胃溃疡指数（胃溃疡抑制率）为63.4%，ST发酵豆浆组为41.6%。雷尼替丁是一种具有良好药效的治疗胃溃疡药物，灌胃雷尼替丁小鼠的胃溃疡面积和指数大大下降，为（1.31±0.24）mm2和80.1%。

发酵豆浆不仅能提供易于消化营养和能量给胃溃疡患者，其含有的部分功能性物质还能对胃溃疡起到预防作用，其中重要的一个功能性成分就是大豆异黄酮。大豆黄素和金雀异黄素是最易被人体利用的大豆异黄酮，大豆异黄酮是一种有效的抗氧化剂，同时也是一种对炎症有预防和抑制效果物质[14]。胃溃疡表现为胃黏膜组织损伤，也引发组织出现炎症，出现胃溃疡的情况下由于胃部不适，患者进食困难，慢性胃溃疡患者长期进食困难，还会引起营养不良、免疫力下降等问题[15]。豆浆既能在一定程度上满足患者的营养需要，其含有的功效成分还有利于缓解胃溃疡，而发酵后的豆浆，由于生产了更多的发酵产物，营养更为均衡[16]，更有利于患者补充营养，增强自身抵抗力和修复组织损伤的能力，同时发酵后豆浆中的不宜被人体吸收的部分大豆异黄酮中转化为更易吸收的大豆黄素和金雀异黄素这两种大豆异黄酮物质[13]，能更好的起到对炎症的抑制作用。有研究[17]也表明，金雀异黄素及其苷元是大豆异黄酮中含量最高的成分，是大豆异黄酮产品中最有效的功能成分，具有多种生理功能，包括抗溃疡作用。金雀异黄素分子与功能性生物大分子相互之间的作用不理想，使得其在人体中的作用减弱，加之金雀异黄素亲水性弱，进入体内迅速被代谢，金雀异黄素含量低的食品起到功能性效果不明显[18]。大豆制品经过发酵后其功能性大分子化合物许多被分解为小分子化合物[8]，与金雀异黄素的相互作用可能得到了加强，同时采用更好的发酵菌种发酵增加了金雀异黄素的生成，使发酵豆浆中的金雀异黄素含量增加，可以增强营养价值、改善功效。牦牛酸乳中分离的LFZ发酵的豆浆比商业嗜热链球菌发酵的豆浆产生了更多的大豆黄素和金雀异黄素，LFZ发酵豆浆的保健功能也更优越，表现出的对胃溃疡的预防效果也更为明显。

2.4 不同菌种发酵豆浆的对小鼠细胞因子的影响

由图3可知，相对于正常组，胃溃疡对照组的IL-6、IL-12、TNF-α和IFN-γ细胞因子水平明显著增加（P＜0.05）；而LFZ发酵豆浆和ST发酵豆浆组均能不同程度降低IL-6、IL-12、TNF-α和IFN-γ细胞因子水平，LFZ发酵豆浆组表现更为明显，雷尼替丁组的细胞因子水平较对照组大幅度降低，最为接近正常组。胃溃疡发生后引发胃部组织炎症，血液中的炎症相关细胞因子发生改变，IL-6、IL-12、TNF-α和IFN-γ是最为典型的炎症相关因子，出现炎症时，这4种因子在血液中的含量会明显升高[19]，由此可以看出LFZ发酵豆浆对胃溃疡的预防作用较商业嗜热链球菌发酵的豆浆更为明显。发酵豆浆中最重要的功能性成分是大豆异黄酮，经过发酵后大豆黄素和金雀异黄素这两种大豆异黄酮中主要成分的质量浓度显著升高，大豆异黄酮则可能是抗胃溃疡作用的主要成分。

图3 不同菌种发酵豆浆对小鼠细胞因子的效果Fig.3 Effect of soybean milk fermented by different strains on cytokine levels in mice

2.5 不同菌种发酵豆浆对小鼠血清因子的影响

由图4可知，相对于正常组，胃溃疡对照组小鼠表现出最高的MOT和SP因子水平和最低的SS和VIP因子水平；而正常组小鼠表现出相反的趋势。LFZ发酵豆浆和ST发酵豆浆组均能显著降低血清MOT和SP因子水平，增加SS和VIP因子水平（P＜0.05）。LFZ发酵豆浆组小鼠的各血清因子水平最接近正常组和阳性对照雷尼替丁组，表现出最好的胃溃疡预防效果。MOT和SP是兴奋性胃肠激素，被刺激后含量升高，MOT被刺激后能引起胃酸大量分泌[20]，大量胃酸会加剧胃溃疡程度[21]。SS和VIP是抑制性胃肠激素，可以抑制胃酸的分泌[22]。LFZ发酵豆浆灌胃小鼠的胃酸分泌被更好地抑制，胃溃疡引起的血清因子变化减弱，表现出更好的胃溃疡预防效果。

图4 不同菌种发酵豆浆对小鼠血清因子的效果Fig.4 Effect of soybean milk fermented by different strains on serum factor levels in mice

3 结 论

从本实验结果可以看出，LFZ发酵豆浆的抗人工胃液和胆盐能力均与一般商业嗜热链球菌有明显差异，LFZ较商业嗜热链球菌具有更强的耐受人工胃液和胆盐能力。通过成分测定也可以看出LFZ发酵豆浆中的大豆黄素和金雀异黄素明显高于嗜热链球菌发酵豆浆。结合利血平诱导胃溃疡动物实验，从对胃功能性效果方面对两种菌株发酵的豆浆进行动物实验后，通过对小鼠胃组织损伤面积血浆中因子水平进行比较，得出LFZ发酵豆浆能更好地缓解胃组织因为利血平造成的损害，具有更好的胃保护功能。综合本实验中各项结果可以看出牦牛酸乳中分离的乳酸菌LFZ发酵豆浆中的功能性成分大豆异黄酮含量升高，发酵豆浆具有更好的品质和保健功效，充分利用牦牛酸乳中分离得到的乳酸菌可以开发生产出品质更优的发酵制品。

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Gastric Ulcer-Preventive Activity of Lactobacillus fermentum Zhao Isolated from Yak Yogurt

ZHAO Xin, QIAN Yu*
(Department of Biological and Chemical Engineering, Chongqing University of Education, Chongqing 400067, China)

Lactobacillus fermentum Zhao (LFZ), a novel strain of Lactobacillus isolated from naturally fermented yak yogurt in the Qinghai-Tibet Plateau in western Sichuan, has been found to have good viability in simulated gastric fluid and stronger cholate resistance than Streptococcus thermophilus (ST). This study aimed to compare the gastric ulcer-preventive activity of LFZ-fermented soybean milk with the commercial ST-fermented sample when orally administered to mice. By using reserpine-induced gastric ulcer mice model as a control group, IL-6, IL-12, TNF-α and IFN-γ cytokine levels of the mice in LFZ group were lower than those of the mice in ST group. The serum SS (somatostatin) and VIP (vasoactive intestinal peptide) levels of LFZ mice were higher than those of ST mice, and the MOT (motillin) and SP (substance P) levels were lower than those of ST mice. The gastric ulcer area of LFZ mice was also smaller than that of ST mice. These results suggest that LFZ-fermented soybean milk shows better quality and gastric ulcer-preventive activity than the ST-fermented one.

soybean milk; Lactobacillus; amino nitrogen; isoflavone; gastric ulcer

TS201.1

A

1002-6630（2014）17-0236-05

10.7506/spkx1002-6630-201417045

2013-09-02

重庆市教委科学技术研究项目（KJ131501）

赵欣（1981—），男，教授，博士，研究方向为功能性食品。E-mail：foods@live.cn

*通信作者：骞宇（1976—），女，讲师，博士，研究方向为食品微生物。E-mail：foodmed@live.com