PDGF-BB对SK-BR-3乳腺癌细胞迁移、增殖的影响

步玉辉，史建红，崔乃鹏，何 欢，王 冰，陈保平

(1河北大学附属医院，河北保定071000;2河北大学)

目前乳腺癌的预防、诊断和治疗已经取得长足进步，但部分患者确诊时已出现局部浸润和转移，5年生存率很低［1］。研究发现，血小板源性生长因子(PDGF)在肿瘤血管形成、肿瘤的生长和转移中起重要作用，可能参与了乳腺癌的增殖和转移过程［2］。2013年 9月 ～2014年 1月，我们观察了PDGF-BB对乳腺癌SK-BR-3细胞迁移、增殖的影响，旨在进一步探讨乳腺癌增殖、转移的分子生物学机制及其干预方法。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞株及培养条件 人源性SK-BR-3乳腺癌细胞购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。用含10%胎牛血清及100 U/mL青霉素、链霉素的 RPMI 1640培养基，于37℃、5%CO2、相对湿度90%的培养箱中培养，定期换液传代，取对数生长期细胞进行实验。

1.1.2 主要试剂 RPMI1640培养基购自Gibico公司，胎牛血清购自Biological公司，胰蛋白酶消化液购自Sigma公司，PDGF-BB购自Pepro Tech公司;MTS CellTiter 96 A Queous One Solution Cell Proliferation Assay Kit购自Promega公司

1.1.3 仪器与设备 CO2培养箱(美国Thermo公司)，超净台(青岛海尔股份有限公司)，全自动多功能酶标仪(美国Thermo公司)，倒置显微镜(Olympus公司 CKX41);高速冷冻离心机(德国 Sigma公司)，Countstar细胞计数仪(上海睿钰生物科技有限公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 PDGF-BB对SK-BR-3细胞迁移能力影响的观察 采用划痕试验。收集对数生长期SK-BR-3细胞，调整细胞浓度为5×105/mL，铺于6孔板中的血盖片上，每孔样品体积为100 μL，另加入10%胎牛血清 RPMI 1640培养基2 mL。设定1个孔为对照组不加药，4孔加PDGF-BB使其终浓度分别为0.5、1、2、4 ng/mL，弃 1 个孔。于 37 ℃、5%CO2、相对湿度90%的培养箱中培养24 h，改用含2%胎牛血清的RPMI 1640培养基培养24 h，用移液管尖端在每孔血盖片相同位置作线性划痕，PBS洗去漂浮细胞，保持PDGF-BB浓度不变，继续培养12、24、48 h，倒置显微镜下测量其迁移距离。

1.2.2 PDGF-BB对SK-BR-3细胞增殖能力影响的观察 采用CellTiter 96 A Queous单溶细胞增殖试剂盒。按说明书要求，取96孔板每孔加入100 μL含10%胎牛血清RPMI 1640培养基，细胞计数调整为2×104/mL，于 37 ℃、5%CO2、相对湿度 90%的培养箱中培养24 h，改用含2%胎牛血清的RPMI 1640 培养基培养 24 h，加入终浓度分别为 0、0.5、1、2、4 ng/mL 的 PDGF-BB 培养 24 h。取 10 μL 细胞悬液与0.2%台盼蓝溶液混合染色至计数板上计数仪计数。每孔加入20 μL增殖试剂于相同条件下培养4 h，使用全自动多功能酶标仪检测其490 nm波长的OD值。

1.3 统计学方法 采用SPSS18.0统计软件。所有结果至少重复3次，数据以±s表示，组间比较采用方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PDGF-BB对SK-BR-3细胞迁移能力的影响不同浓度PDGF-BB培养12、24、48 h后SK-BR-3细胞平均迁移距离见表1。由表1可见，PDGF可增强SK-BR-3细胞的迁移能力，平均迁移距离与PDGFBB浓度及时间呈正相关(P均＜0.05)。

2.2 PDGF-BB对SK-BR-3细胞增殖能力的影响0、0.5、1、2、4 ng/mL 的 PDGF-BB 培养 24 h 后 SKBR-3平均细胞计数分别为 1.02 ×104、3.81 ×104、6.41 ×104、2.54 ×105、6.82 ×105，继续加入增殖试剂后于490 nm处测平均 OD值分别为1.012、1.719、2.692、3.934、5.877，SK-BR-3 平均细胞计数及平均OD值与PDGF-BB浓度及时间呈正相关(P均 ＜0.05)。

表1 不同浓度PDGF-BB干预后SK-BR-3细胞平均迁移距离比较(±s)

表1 不同浓度PDGF-BB干预后SK-BR-3细胞平均迁移距离比较(±s)

PDGF-BB浓度(ng/mL) 平均迁移距离(cm)干预12 h 干预24 h 干预48 h 0 0.2 0.4 1.0 0.5 0.4 0.8 1.0 1 1.0 1.2 1.2 2 1.2 1.6 2.0 4 1.6 1.8 2.2

3 讨论

PDGF可促进平滑肌细胞以及其他间充质来源细胞的分化、增殖［3］。胚胎发育过程中，PDGF在肾脏、血管、肺和中枢神经系统发生过程中起着举足轻重的作用。PDGF过表达可能引起和促进某些恶性肿瘤的发生发展［4］。目前发现 PDGF家族包括PDGF-A、PDGF-B、PDGF-C 以及 PDGF-D，其在自然界主要以由二硫键连接的PDGF-A和PDGF-B同源或异源二聚体的形式存在，即PDGF-AA、PDGF-BB和 PDGF-AB［1］。

本研究结果显示，PDGF-BB可增强SK-BR-3细胞的迁移能力，此效果与PDGF-BB浓度及作用时间呈正相关。文献报道，PDGF在肿瘤细胞中过表达，且与肿瘤的生物学属性及复发、转移密切相关［5～8］。PDGF可以与含有β-酪氨酸激酶受体的PDGF受体α、β特异性结合，进而促进创面愈合。这两种受体的胞外结构域类似，且均由五种免疫球蛋白组成，而胞内部分则由大约100个非同源性的氨基酸残基的激酶区域组成。与PDGF结合主要发生在类免疫球蛋白的2和3区域，但是稳定性不如与类免疫球蛋白4区域结合［9，10］。PDGF与其受体结合导致胞内相邻部分的自身磷酸化。这种自身磷酸化有两种重要的功能。首先它改变了胞内受体的构象，激活激酶。目前仍然没有对PDGF受体三维结构的准确描述，对其控制机制的研究也还是空白，但是有三种假说:①激酶结构域中激活环的折叠很可能掩盖了激活位点，自身磷酸化的发生使得该激活位点暴露［11］;②膜受体可能折叠在激活环中，该区域的两种酪氨酸残基的自身磷酸化改变激酶构象使其激活［12］;③受体的C末端可能折叠掩盖激酶的结构域，酪氨酸C末端的自身磷酸化使得激酶激活［13］。第二自身磷酸化可与SH2结构域发生特异性结合。PDGFRα和PDGFRβ分别包含10个和11个已知的自身磷酸化的酪氨酸残基［14］。鉴于PDGF对肿瘤侵润转移有促进作用，故可寻求PDGF的受体作为治疗肿瘤的重要的分子靶点。

本研究结果显示PDGF-BB可促进SK-BR-3细胞增殖，并与浓度和时间存在依赖性。其机制可能是PDGF-BB-PDGFR-β信号通路激活并启动促红细胞生成素系统，其主要通过转录因子Atf3的转录调节，此外还可能有两个辅助性转录因子c-Jun、Sp1参与转录。PDGF-BB通过促红细胞生成素促进肿瘤生长的分子机制主要是:①肿瘤血管形成时的旁分泌刺激产生促红细胞生成素，而肿瘤血管是由内皮细胞直接诱导增殖、迁移、出芽形成的;②PDGFBB还可诱导促红细胞生成素mRNA并使其过表达，进而促进肿瘤毛细血管网的形成，增加氧灌注和防止肿瘤出现相关性贫血［15］。有研究证实，PDGFBB 能够刺激肿瘤血管形成［16～18］。因此，PDGF-BB可作为诊断肿瘤和判断其预后的标志之一。由于PDGF信号通路的存在，我们推测促红细胞生成素水平升高可能影响抗肿瘤血管生成治疗的效果。正确选择特异性PDGF受体抑制剂，抑制其信号通路将为寻找新的抑制肿瘤浸润转移的化疗药物、降低肿瘤复发转移提供新思路，为延长患者寿命开辟新路径。

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