粒度对固态发酵豆粕产肽的影响研究

■管军军 李世豪 韩丙倩 程云龙

（河南工业大学生物工程学院，河南郑州450001）

固态发酵豆粕，是利用固态发酵手段，将豆粕这种植物源蛋白与微生态技术相结合，提升豆粕的营养价值，改善豆粕适口性的技术。固态发酵豆粕是目前研究的热点，随着发酵技术的进步，发酵豆粕的品质也不断提高，不过发酵过程中依然有一些问题亟待解决。目前对于发酵豆粕的研究主要集中在优化菌种配比，发酵条件如发酵温度，pH值，发酵时间等，但研究豆粕粒度对发酵结果影响的较少[1]。

固态发酵过程中基质粒径对发酵前中后期都有巨大影响，目前对其研究较少是因为不同的发酵基质形态差别较大，其结果不具有普适性。不过对于豆粕来说，由于生产加工手段的相对标准化，豆粕粒度基本保持在一个可控的范围内[2]，因此研究不同豆粕粒度对于发酵结果的影响具有一定的意义。

豆粕粒径对固态发酵的影响主要体现在两点，豆粕间隙含氧量及菌体与基质接触面积。由于固态发酵的通风散热相对液态发酵困难，因此，发酵基质间隙氧含量对于发酵结果影响很大；同样菌体与基质接触面积大，则对基质的降解更加充分，发酵效率更高[3]。本试验旨在得出豆粕发酵的最佳粒度，为固态发酵豆粕技术的发展做出贡献。

1 试验与方法

1.1 试验材料

豆粕：粗蛋白含量46%，酸溶性小肽含量1.22%（河南阳光油脂集团）；枯草芽孢杆菌BS-GA15（润盈生物工程[上海]有限公司）；小分子蛋白标准样品（Marker）（生工生物工程[上海]有限公司）；其他试验药品均通过郑州新丰化验器材有限公司购买。

1.2 主要仪器设备

XSB-88型顶击式振动机，筛摇次数221次/min，振击次数147次/min；4～100目分样筛；SF-400电子秤；SPX-250B智能型生化培养箱；JP-100A-2高速多功能粉碎机；TGL-16B台式离心机；TDL-5-A台式离心机；JY600C电泳仪；722N可见分光光度计；DHG-9070B智能型电热恒温鼓风干燥箱。

1.3 试验设计

1.3.1 豆粕粒径分布的测定

根据振动机装填量及对豆粕粒度的初步判断选择4、8、12、16、20、40、60、80、100目孔径的筛子对豆粕筛分。为排除取样误差，按照四分法，取样5次，筛子按照孔径由大到小顺序依次向下叠摞。将所取样品依次加入4目筛中，放入振动机中振动10 min，取下筛子，分别称量各个筛子中豆粕质量，计算平均值，按照质量比例确定不同粒径豆粕在总体中所占比例。

1.3.2 豆粕空隙率的测定及比表面积

参照GB/T 5518-2008粮食、油料相对密度的测定中的量筒法，在室温（22±5）℃下，向量筒中加入20%乙醇10 ml，然后放入样品约5 g（精确至0.01 g），稍加摇动，逐出气泡，待液面平稳后，立即读出液面上升体积（V1），称量相同质量豆粕，放入量筒中读出体积（V2）。则空隙率=（V2-V1）/V2。其比表面积根据豆粕直径大小计算得到。

1.3.3 发酵试验

1.3.3.1 培养基及发酵

发酵选用菌种为枯草芽孢杆菌，在发酵过程中，随着菌体的繁殖，能够产生大量蛋白酶[4]，促进小肽的生成。为了使菌种更好地适应固态发酵环境，种子液培养基用优化的豆粕培养基：100目以下豆粕40 g，葡萄糖20 g，蒸馏水1 L；接种量按照质量体积比9∶1接种，即每100 g发酵基质，接种10 ml对数期种子液；料水比6∶4；发酵前，先将种子液混入所需体积水中，摇匀后拌入豆粕中，搅拌均匀后覆盖8层无菌纱布进行发酵。

发酵所用的豆粕是具有代表性的4～8目,16～20目，20～40目，80目以下4种粒径的豆粕，原始豆粕作为对照组，每组设3个重复试验；发酵温度32℃，每12 h取一次样，共取5次，共计发酵时间60 h。样品在50℃下烘干8 h，之后粉碎筛选60目以下样品，测定其酸溶性小肽的含量，并以其含量的高低判断发酵结果的优劣。

1.3.3.2 酸溶性小肽测定

酸溶性小肽是豆粕中大分子蛋白质降解后的产物，研究表明小肽比蛋白质、氨基酸更容易吸收，因此酸溶性小肽含量的高低能够反映发酵结果的优劣[5]。本试验采用双缩脲法测定酸溶性小肽含量。具体方法：称取1 g豆粕样品，定容于50 ml 15%三氯乙酸溶液中，摇匀后静置5 min，提取其中的酸溶性蛋白，然后过滤取滤液；准确取1 ml滤液于试管中，加入5 ml 0.1 g/ml NaCl溶液，使溶液呈碱性，摇匀后加入1 ml 0.01 g/ml CuSO4溶液并摇匀，反应30 min后将反应液在4 000 r/min条件下离心5 min。取上清液在540 nm下测定吸光度。用同样的方法，测定一系列已知浓度的牛血清蛋白溶液，制作标准曲线，并计算各样品中小肽含量。

1.3.3.3 发酵过程中豆粕体积变化

豆粕加水后，体积膨胀，发酵开始后，由于水分的蒸发等因素，豆粕的体积又会收缩，缩小的体积与发酵前（加水后）体积的比值记作豆粕体积收缩率（Vs）。Vs在每次取样前通过测定发酵豆粕界面下降高度计算得到。这个数值能反映发酵状态下豆粕颗粒间氧含量的变化。

1.3.4 数据处理

数据利用SAS 9.0软件进行分析。

2 结果和讨论

2.1 豆粕粒度分布

按照上述试验方法，对豆粕进行筛分，豆粕全部通过4目筛，以相邻筛子孔径值为区间，对豆粕粒径进行划分。不同粒径豆粕在总样品的含量比值见图1。

图1 不同粒径豆粕在总样品中含量

从图1可以看到，豆粕中各粒径分布呈现中间高，两边低的趋势；16～20目，20～40目的豆粕最多，各占22%，共占所有豆粕的44%，接近一半；8～60目豆粕共占总样品的86%；说明在一定粒径范围内分布比较集中。发酵试验选择4～8目豆粕（其粒径最大），16～20目豆粕，20～40目豆粕（含量最多），以及粒径最小的80目以下豆粕，原始豆粕为对照组，依次将其编号为A、B、C、D、E。

2.2 豆粕空隙率

参照GB/T 5518-2008所测得各粒径空隙率如图2所示。

图2 各粒径豆粕空隙率

从图2可以看出，空隙率的变化为先降低后升高，其中最低点为20～40目的豆粕。影响豆粕空隙率的因素有豆粕粒径大小及豆粕颗粒形状。大粒径豆粕，容易构成大的颗粒间空隙，因此4～40目的豆粕，粒径越大，空隙率越大；但是40目以下粒径的豆粕，自身表面有更多的突起，使得堆积状态下豆粕显得更膨松，也就是空隙率更大。显微镜下观察不同粒径豆粕颗粒，如图3所示，豆粕颗粒表面是凹凸不平的，并且有许多刺状或耳装突起。这些突起使得豆粕堆积期间不能完全整齐排列，形成豆粕间空隙。空隙率是体现发酵初期基质间氧含量的重要指标，氧含量越高，好氧菌的繁殖越快，能够缩短发酵时间。

2.3 不同粒径豆粕的比表面积

豆粕的比表面积会影响细菌与豆粕的接触面积，发酵过程中，细菌与豆粕的接触面积越大，豆粕被分解的速率越大。A、B、C、D、E 5种粒径的豆粕比表面积基本与直径成反比。直径越大，比表面积越小，因此比表面积A＜E＜B＜C＜D。

2.4 发酵过程中体积收缩率的测定

将样品A、B、C、D、E按照料水比6∶4加水接种后，在发酵过程中，由于水分的蒸发，微生物的降解，豆粕表面的突起逐渐变小，变平，豆粕颗粒之间距离变小，豆粕总体积降低。发酵所用的各粒径豆粕的体积变化如图4所示。

豆粕体积收缩率表示发酵过程中基质间隙的减小，这表示豆粕间溶氧的减小，从图4可以看到，粒径越大的豆粕，体积收缩越小。这是因为粒径大的豆粕，边缘突起更加坚固，经发酵后还能保持一定的硬度，能够保持空隙的形成。而粒径小的豆粕，经过水的浸泡，微生物的侵蚀，硬度降低，凸起的边缘提供的摩擦力小于豆粕自身的重力，因此豆粕整体体积收缩。

图3 不同粒径豆粕显微观察

图4 发酵过程中豆粕体积收缩率

2.5 发酵试验结果

对发酵过程中取出的样品进行测定，其酸溶性小肽含量见表1。

表1 发酵过程中不同粒径豆粕产酸溶性小肽含量(%)

对24 h各个样品，以及80目以下试验组各个样品处理后，进行SDS-PAGE电泳，观察豆粕中蛋白分解为酸溶性小肽的情况，如图5所示。

图5 各粒度试验组在24 h的发酵样品电泳图

图5中，1、2、3、4、5对应A、B、C、D、E五种粒度，M为Marker条带。由图5可以看出80目以下粒径试验组在24 h时，大分子蛋白降解最多，与表1中该取样点有最优试验结果相符合。

对同一时间段的结果进行多重比较，发酵12 h及24 h，80目以下粒径豆粕发酵结果较其他粒径极显著，发酵结果最好，而4～8目豆粕酸溶性小肽含量最低；发酵36 h以后，各粒径豆粕发酵结果差异不显著；由此可知，豆粕粒径不同对于发酵结果的影响作用在36 h之前，36 h之后，粒径因素对发酵结果影响不显著。

由表1可知，发酵时间12 h，粒径最小的豆粕肽含量最高，这与其最大的空隙率成正相关。但20～40目试验组的肽含量比4～8目及16～20目试验组高，这是因为20～40目试验组豆粕比表面积更大，微生物与豆粕接触面积大，对豆粕利用效率更高。

整个发酵过程中，酸溶性小肽含量最高值为7.66%，对应样品为80目以下豆粕，发酵24 h。可以看出空隙率高，比表面积大对于前期菌种的繁殖起到了积极的作用。

不过在36 h以后，除了80目以下试验组酸溶性小肽含量开始降低外，其余试验组小肽含量仍呈上升状态。结合发酵过程中豆粕体积的收缩率，可以发现，80目以下豆粕在各个时间段体积收缩最多，豆粕间隙越来越小，36 h时不能满足细菌的继续生长，细菌进入衰退期，反而消耗小肽。而且80目以下豆粕含量只有3%，如果用这个粒度发酵则需要对豆粕进行粉碎处理，需要消耗巨大能量，综合比较，选取含量较多的20～40目豆粕进行发酵较为合适。

3 结论

豆粕中不同粒径的豆粕含量分布呈现中间高，两边低的趋势，并且16～40目的豆粕占到44%的比例。

豆粕的空隙率呈现两边高，中间低的趋势，最低点出现在20～40目豆粕处，40目以下的豆粕空隙率普遍比40目以上豆粕大。

较大的豆粕空隙率与比表面积都能在一定程度上提升发酵结果，但是在它们最大的时候，豆粕粒径却是最小的，在发酵过程中，体积收缩率最大，不利于长时间发酵。

最佳发酵条件为粒径80目以下豆粕，发酵24 h，但考虑到80目以下豆粕含量只占3%，因此可以考虑含量最大的粒径20～40目豆粕发酵。