响应面法优化肉鸡无抗饲料发酵工艺的研究

■ 杨建松 王 露 刘 燕 王亚军 王德培，2

（1.天津科技大学生物工程学院，天津 300457；2.工业微生物教育部重点实验室，天津 300457）

随着社会经济的发展，人们越来越重视肉食品中抗生素的残留问题[1]。由于抗生素的滥用和耐药性问题，人们逐渐把目光转向了微生物发酵饲料的研究[2]，这样能为生产安全、无毒、无抗生素的肉食品开辟一条新的途径[3]。

发酵饲料不仅可以改善饲料营养吸收水平，降解饲料原料中的毒素，还能减少抗生素等药物类添加剂的使用[4]。发酵所用的乳酸菌能产生乳酸菌素和大量有机酸等，同时形成厌氧环境，抑制大肠杆菌等致病菌的增殖[5]。芽孢杆菌能产生多肽类抗生物质，有益菌的增殖还能激活免疫系统，促进免疫细胞成熟[6]，这些都与动物健康密切相关。常规发酵工艺优化多采用将其他因素固定，每次改变一个因素的方法，这种方法费时费力，且容易忽略因子间的交互作用而得出错误的结论[7]，响应面法可同时对各因子水平及其交互作用进行优化与评价，可快速有效地确定多因子系统的最佳条件，该方法可以简化试验步骤，提高准确性[8]。

本文以前期筛所选出的乳酸菌和芽孢杆菌作为肉鸡饲料的发酵菌株，采用固体混菌厌氧发酵，通过响应面法对发酵工艺经行分析和优化。运用Plackett-Burman设计、最陡爬坡实验以及Box-Behnken设计得到最佳发酵工艺，使各个菌种能够发挥优势，从而制备出较好的无抗肉鸡发酵饲料。

1 材料与方法

1.1 实验菌株

枯草芽孢杆菌BI1(Bacillus subtilis BI1)、枯草芽孢杆菌 WL-BA-1(Bacillus subtilis WL-BA-1)、豆粕乳杆菌（Lactobacillus soybean meal）、发酵乳杆菌TLa-6(Lactobacillus fermentum TLa-6)，均由本实验室保藏。

1.2 培养基

LB培养基（g/l）：胰蛋白胨10、酵母浸出粉5、Na-Cl 10，pH值7.2～7.5。

淀粉培养基（g/l）：牛肉膏5、蛋白胨5、NaCl 5、可溶性淀粉20、琼脂18，pH值7.2。

肉汤培养基（g/l）：牛肉膏5、蛋白胨10、NaCl 5，pH值7.2～7.4。

MRS培养基(g/l)：蛋白胨10、牛肉膏10、酵母浸出粉5、葡萄糖5、CH3COONa 5、柠檬酸二胺2、吐温80 1、K2HPO42、MgSO4·7H2O 0.2、MnSO4·7H2O 0.05、CaCO320，pH值6.2。

奶粉培养基(g/l)：脱脂奶粉100、乳糖20，pH值自然。

麦康凯琼脂培养基（g/l）：蛋白胨20、乳糖10、牛胆盐5、NaCl 5、中性红0.03、琼脂18，pH值7.0。

1.3 饲料

实验所用饲料由天津牧丰饲料有限公司提供，经检测其还原糖含量为0.78%，酸溶蛋白含量为0.33%，乳酸和乳酸菌均检测不出。

1.4 培养方法

1.4.1 芽孢杆菌种子液制备

从LB培养基斜面挑取1环菌，接入到装有50 ml肉汤液体培养基的250 ml三角瓶中，放置于温度37℃、转速220 r/min的摇床中振荡培养14 h。

1.4.2 乳酸菌种子液制备

从奶粉培养基里吸取2 ml培养液，接入到装有100 ml MRS液体培养基的250 ml三角瓶中，放置于温度42℃的培养箱中静置培养14 h。

1.4.3 饲料固态发酵

将枯草芽孢杆菌BI1、枯草芽孢杆菌WL-BA-1、豆粕乳杆菌、发酵乳杆菌TLa-6种子液与一定量的水混合，然后再与肉鸡全价料混匀，将其装入发酵瓶置于恒温箱培养。

1.5 测定方法

1.5.1 还原糖含量的测定

采用DNS法测定发酵饲料中还原糖的含量。

1.5.2 乳酸含量的测定

称取发酵饲料5.00 g置于装有50 ml蒸馏水的250 ml三角瓶里，浸提1 h，离心取上清液，然后用SBA-40E型生物传感分析仪测定其中乳酸的含量。

1.5.3 活菌数的测定

乳酸菌用MRS固体培养基作为计数培养基进行计数；大肠杆菌用麦康凯固体培养基作为计数培养基进行计数。

1.6 响应面法分析实验

设计Plackeet-Burman实验,从前期单因素发酵因素中筛选出对发酵饲料品质有重要影响的因素。找出主要因素后，通过设计最陡爬坡实验，使主要因素朝向响应值的最大方向变化，逼近最大相应区间[9]。设计Box-Behnken实验，利用统计软件对数据进行二次回归拟合，在一定水平范围内求取最佳发酵条件。最后对响应面实验得到的最佳条件进行验证实验。

1.7 发酵温度的确定

选取温度为20、30、37、45℃这4个水平进行分析，20℃和30℃发酵5 d，37℃和45℃发酵3 d。

2 结果与分析

2.1 肉鸡饲料发酵条件Plackett-Burman实验

前期实验已筛选出肉鸡饲料发酵所用的2株芽孢菌和2株乳酸菌，并对发酵条件进行了单因素实验，现选用实验次数N=12的实验设计对接种量，2株芽孢菌的比例，2株乳酸菌的比例，芽孢菌与乳酸菌的比例，外加水量5个因素进行考察，每个因素高低2个水平，如表1所示。

表1 Plackett-Burman实验设计因素及编码水平

按照上述实验设计，将发酵瓶放入37℃恒温生化培养箱中发酵3 d后，测定其还原糖、乳酸、大肠菌数和乳酸菌数。如表2所示。以还原糖作为响应值，计算各因素效应，如表3。

由表3可以看出，因素A（接种量），因素D（芽胞菌乳酸菌比例），因素E（外加水量）P值均小于0.05，可作为进一步优化的因素，其他因素对结果影响不大，在进一步研究中，其影响效果不进行分析。

2.2 肉鸡饲料发酵条件最陡爬坡实验

响应面拟合方程只在考察的紧接领域才会近似真实情形，而在其它区域拟合方程则几乎没有意义，所以要先逼近最佳值区域后才能建立有效的响应面拟合方程。最陡爬坡法以实验值变化的梯度方向为爬坡方向，根据各因素效应值的大小确定变化步长，能快速的逼近最佳区域。Plackett-Burman实验已确定三个因素是关键影响因子，根据这三个因素效应大小的比例，设定它们的变化方向以及步长，其他各因素分别取各自的最优水平，设计实验。

表2 Plackett-Burman实验结果

表3 Plackett-Burman实验各因素主效应分析

表4 最陡爬坡实验设计

按照表4设计，将发酵瓶置于37℃恒温生化培养箱中发酵3 d后，测定其还原糖、乳酸、大肠菌数和乳酸菌数。如表5所示。

从表5可以看出，5组实验乳酸含量均在4.0%以上，乳酸菌数均在109CFU/g以上，而第2组的还原糖含量最高，说明以还原糖作为响应值的最优点在第2组附近，故以实验2的条件作为响应面实验因素水平的中心点。

2.3 肉鸡饲料发酵条件Box-Behnken实验

采用Box-Behnken模型，对饲料发酵条件中重要影响因素的水平进一步优化。以Plackett-Burman实验所确定的显著因素即接种量、芽孢菌与乳酸菌比例、外加水量为自变量，分别以X1、X2、X3来表示，并以1、0、-1代表自变量的高、中、低水平，按公式（1）对自变量进行编码，Y为响应值，实验因素的水平和编码如表6所示。

表5 最陡爬坡实验结果

表6 Box-Behnken实验设计因素及编码水平

式中：xi为自变量的编码值；Xi为自变量的真实值；X0为实验中心点处自变量的真实值；△X为自变量的变化步长。

按照上述因素设计，将发酵瓶放入37℃恒温生化培养箱中发酵3 d后，测定其还原糖，乳酸，大肠菌数和乳酸菌数。如表7所示。

以接种量（X1）、接种比例（X2）和外加水量（X3）为自变量，还原糖含量作为响应值(Y)，建立回归模型。根据Box-Behnken设计的实验结果，进行二次回归分析分析，回归方程为：

表7 Box-Behnken实验结果

表8 Box-Behnken实验回归模型方差分析

由表8可以看出回归模型F检验显著（P＜0.01），失拟项在α=0.05水平上不显著，其复相关系数的平方R2=99.14%，表明此模型拟合程度良好，方程应变量与全体自变量之间线性关系明显。

由响应面中各图素交互作用的立体图可知，模型存在稳定点，稳定点是极大值点，通过岭脊分析，得到极大值所对应的各主要因素的编码值（x1、x2、x3）分别为（-0.193 8，0.438 0，0.279 0），从而得到各主要因素（X1、X2、X3）的实际值为（6.806，2.219，55.395），即接种量6.806% ，接种比例2.219∶1，外加水量55.395%。

2.4 Box-Behnken回归模型验证实验

图1 接种量和接种比例对响应值影响的响应曲面

图2 接种量和外加水量对响应值影响的响应曲面

图3 接种比例和外加水量对响应值影响的响应曲面

响应面法得到的最佳条件需进一步验证，按照优化后的发酵条件进行实验，即接种量为6.8%，芽孢菌与乳酸菌的比例为2.2∶1，外加水量为55.4%，37℃恒温生化培养箱中发酵3 d后，测定其还原糖，乳酸，大肠菌数和乳酸菌数。

验证试验结果中还原糖平均值为2.32%，与响应面理论值2.30%非常接近，这表明实验值和实际值之间具有良好的拟合性，从而验证了优化模型的有效性。

2.5 发酵饲料温度的优化

从表10不同发酵温度所得的结果可以看出，20℃和30℃较低温度下发酵5 d与较高温度45℃发酵3 d基本可以达到同样发酵效果。但是在实际生产中，严格控制固态发酵温度难以实现，一方面严格控制温度会增加不必要的成本，另一方面由于发酵过程中产生热量，导致物料堆积中心的温度与边缘的温度差异必然较大。所以通过以上数据可以得出在20～45℃均可以，但在实际生产中控制温度20～30℃作为发酵的温度。

3 结论

本文利用响应面法确定了肉鸡饲料的发酵工艺为接种量为6.8%，芽孢菌与乳酸菌的比例为2.2∶1，外加水量为55.4%，发酵温度范围为20～45℃。按此条件37℃下发酵72 h后还原糖含量增加了1.97%，是发酵前的2.97倍，酸溶蛋白质含量增加了7.73%，是发酵前的8.73倍，乳酸含量增加了4.2%，同时产生了大量益生菌，而且有效的抑制了大肠杆菌。

表9 Box-Behnken回归模型验证试验结果

表10 温度对发酵饲料的影响