银杏复方汤剂对家兔肾脏缺血再灌注损伤模型肾组织的保护作用及机制

成月英，苑 磊，李晓东，郭红伟

(保定市第一中心医院，河北保定071000)

肾缺血再灌注可引起肾小管损伤、缺血、坏死，肾功能严重受损，导致肾功能衰竭。缺血再灌注损伤中由于氧自由基清除剂超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的活性抑制，导致氧自由基大量堆积，细胞受到破坏;丙二醛(MDA)可引起脂质过氧化，导致细胞生物膜通透性增高［1，2］，引起肾缺血再灌注损伤的肾小管上皮细胞变形、坏死，进而导致肾功能异常。细胞间黏附分子-1(ICAM-1)是一种炎症介质，亦参与了肾缺血再灌注的损伤。2011年6月～2012年5月，我们观察了银杏复方汤剂对家兔肾脏缺血再灌注损伤模型肾组织MDA、SOD、GSH-Px及 ICAM-1表达的影响，探讨银杏复方汤剂对缺血再灌注损伤肾组织的保护作用及机制。

1 材料与方法

1.1 材料 健康日本大耳白兔30只，雌雄不分，体质量1 000～1 500 g，由河北医科大学动物饲养场提供。随机分为对照组、再灌注组和治疗组各10只。银杏复方汤剂的组成为银杏叶18 g、灯盏花12 g、黄芪5 g，用清水漂洗、蒸馏水浸泡30 min后常规煎煮，煮沸30 min，滤掉药渣，药液冷藏备用。

1.2 方法

1.2.1 动物分组与模型制作 对照组与再灌注组给予等量生理盐水灌胃，治疗组给予银杏复方汤剂12 mL/kg、1次/d灌胃，共42 d。于最后1次灌胃1 h后手术。3%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，沿腹部正中线切口逐层分离暴露双侧肾脏，分离并切除右肾及肾蒂，游离及保护左肾及左肾蒂。对照组不夹闭左肾及左肾蒂，直接关腹;再灌注组与治疗组均用动脉夹夹闭左侧肾蒂1 h，松夹重新灌注，关腹。术中夹闭左侧肾蒂可见肾脏迅速由鲜红变紫黑，松开动脉夹后恢复血流灌注，可见肾脏迅速由紫黑色变为鲜红，为模型制作成功。

1.2.2 检测方法 各组均于再灌注1 h后处死，取缺血肾组织用10%中性甲醛固定。①肾组织学改变:取肾组织常规脱水，石蜡包埋，制成3 μm厚切片，HE染色，光镜下观察肾间质小管结构变化。②肾组织ICAM-1表达:取肾组织石蜡切片，应用免疫组化法检测肾组织ICAM-1表达，以细胞质中出现棕黄色染色为阳性，未着色为阴性。先于光镜下判定有无阳性表达，然后采用计算机图像灰度分析测定平均灰度值。③脂质过氧化损伤指标测定:使用SOD、GSH-Px、MDA试剂盒，采用硫代巴比妥酸(TBM)法比色和黄嘌呤氧化法测定肾组织中MDA含量和SOD、GSH-Px活性。

1.2.3 统计学方法 采用 SPSS14.0、SPSS16.0 统计软件，结果以±s表示，组间比较采用t检验。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组肾小管组织形态学改变 对照组肾小管间质病变轻微，肾小管轮廓清晰可见，肾小管上皮细胞排列规整，肾间质无明显炎性细胞浸润;再灌注组小管间质病变较重，肾小管上皮细胞排列紊乱、部分细胞肿胀变性，肾间质充血水肿，少量炎性细胞浸润;治疗组较再灌注组肾小管上皮细胞排列稍整齐，上皮细胞肿胀变性减轻，肾间质充血、水肿好转。

2.2 各组肾组织ICAM-1、MDA、SOD、GSH-Px比较治疗组ICAM-1表达、MDA含量明显低于再灌注组，SOD、GSH-Px活性明显高于再灌注组(P均＜0.05)，治疗组与对照组比较无统计学差异(P均＞0.05)。见表1。

表1 各组肾组织中ICAM-1、MDA和SOD、GSH-Px 比较(±s)

表1 各组肾组织中ICAM-1、MDA和SOD、GSH-Px 比较(±s)

注:与再灌注组比较，*P ＜0.05

组别 n ICAM-1 MDA(mmol/g)SOD(U/g)GSH-Px［U/(mg·prot )］对照组 10 9.38 ±1.05 3.412 ±0.701 28.120 ±2.108 67.176 ±3.212再灌注组 10 35.21 ±1.75 6.702 ±1.611 21.091 ±1.715 23.092 ±1.891治疗组 10 10.83 ±1.19* 4.422 ±1.312*29.710 ±1.124*52.108 ±1.492*

3 讨论

肾缺血再灌注损伤的机制复杂，与氧自由基生成过多、细胞内钙超载、中性粒细胞及补体系统活化、细胞凋亡、脂类参与、一氧化氮、内皮素等因素有关，是一个多因素参与的病理生理过程。其中氧自由基在肾缺血再灌注损伤中起重要作用［3］。肾缺血再灌注损伤以肾小管损伤为主，其机制可能是:肾小管上皮细胞中的溶酶体被激活，释放大量溶酶体酶于肾小管上皮细胞质，导致上皮细胞刷状腺脱落，上皮细胞结构被破坏，细胞完整性消失，上皮细胞严重受损导致肾功能衰竭。肾小管细胞受损后释放多种炎症介质及趋化因子，促进炎症反应及肾间质纤维化形成，加重肾损害。本研究显示，家兔肾缺血再灌注损伤后肾组织中SOD、GSH-PX活性下降，MDA含量升高，说明缺血再灌注过程中肾脏组织会产生大量氧自由基及脂质过氧化物。

银杏复方汤剂由银杏叶、灯盏花和黄芪组成。银杏叶的主要功效成分是黄酮醇类化合物和萜内酯类化合物，具有扩张血管，改善脑循环，抑制血小板凝聚酶等作用，对脑血栓、心绞痛、心肌梗死有良好的治疗作用［4，5］。动物实验显示，银杏叶提取物能防止脑水肿模型大鼠脑缺血缺氧引起的氧化磷酸化脱偶联反应，保持细胞内线粒体的正常功能，防止细胞内Ca2+超载，保护损伤的脑细胞［6］;对阿尔茨海默病大鼠具有神经保护作用［7］。灯盏花中含有还原性酚羟基，具有清除羟氧自由基、过氧自由基、抑制脂质过氧化等作用［8］。黄芪具有增强免疫功能、提高机体应激及耐缺氧能力、促进机体代谢等功效。顾燕等［5］发现，银杏叶提取物能提高大鼠肾组织中SOD活性，抑制肾皮质中MDA含量，抑制脂质过氧化，保护大鼠肾缺血再灌注损伤;贾孟良等［9］报道，银杏叶提取物能减轻小鼠肾小管上皮细胞缺血性改变，保护小鼠肾脏急性缺血再灌注损伤，降低肾组织中MAD含量，保护肾脏。本研究显示，银杏复方汤剂干预组肾脏SOD、GSH-PX活性上调，MDA含量降低，说明其可减轻家兔肾脏缺血再灌注后的氧化应激，保护肾脏。炎症因子ICAM-1参与了肾缺血再灌注的损伤机制。正常情况下，ICAM-1在肾小球及肾小管细胞无表达，在肾组织严重缺血缺氧状态下，ICAM-1能激活多种炎症因子及炎症介质，最终导致肾损伤［10］。本研究显示，应用银杏复方汤剂使肾小球毛细血管内皮细胞中ICAM-1表达明显降低，说明银杏复方汤剂能抑制炎症介质释放，从而保护缺血再灌注肾损伤。

综上所述，银杏复方汤剂能降低缺血再灌注损伤家兔的肾组织MDA含量，升高SOD、GSH-Px活性，显著降低肾小球毛细血管内皮细胞ICAM-1表达，对家兔缺血再灌注损伤具有明显保护作用。

［1］Sehramm L，Weierieh T，Heldbreder E，et al.Endotoxin-induced acute renal failure in rats:effeets of L-arginine and nitree oxide synthase inhibition on renal function［J］.Nephol，2005，18(1):374-381.

［2］Spek CA，Bruggemann LW，Borensztajn KS.Protease-activated receptor 2 blocking peptide counteracts endotoxin-induced inflammation and coagulation and ameliorates renal fibrin deposition in a rat model of acute renal failure［J］.Shock，2010，33(3):339-340.

［3］贾辉，刘志勇.乌司他丁对肾脏缺血再灌注损伤的保护［J］.江苏医药，2005，31(3):194-196.

［4］雷载权.中药学［M］.上海:上海科学技术出版社，1994:235-240.

［5］顾燕，刘萌，张现涛，等.高效液相色谱法测定银曲胶囊中银杏总黄酮醇苷的含量［J］.时珍国医国药，2008，8(19):2016-2017.

［6］陈修.银杏叶提取物的心脑血管药理研究进展与启示［J］.中国中西医结合杂志，1996，16(7):387-389.

［7］王暖，黄红莉，周昊，等.银杏叶提取物对阿尔茨海默病大鼠的神经保护作用及其机制探讨［J］.山东医药，2013，53(36):31-33.

［8］贾俊海，周留正，陈素仙.灯盏花素对大鼠肾脏缺血再灌注损伤的保护作用［J］.江苏医药，2011，37(5):506-508.

［9］贾孟良，谢守霞，张万帆，等.银杏叶提取物对急性缺血再灌注损伤小鼠肾脏的保护作用研究［J］.医药导报，2006，25(8):549-552.

［10］何亮，李俊杰，蒋姝乐，等.小剂量多巴胺在肾缺血再灌注损伤中的抗损伤作用［J］.昆明医学院学报，2009，30(7):25-28.