聚乳酸/乙醇酸可吸收医用膜对兔腹腔术后粘连的预防作用研究

庞秀炳，潘永明，华菲，孙朝英，陈亮，陈方明，朱科燕，徐剑钦，陈民利

1 浙江普洛医药科技有限公司，东阳市，322118

2 浙江中医药大学动物实验研究中心，杭州市，310053

聚乳酸/乙醇酸可吸收医用膜对兔腹腔术后粘连的预防作用研究

【作 者】庞秀炳1，潘永明2，华菲1，孙朝英1，陈亮2，陈方明2，朱科燕2，徐剑钦2，陈民利2

1 浙江普洛医药科技有限公司，东阳市，322118

2 浙江中医药大学动物实验研究中心，杭州市，310053

目的 研究聚乳酸/乙醇酸可吸收医用膜对兔腹腔术后粘连的预防作用。方法 日本大耳白兔66只，随机分成3组，正常对照组n=6，模型对照组n=30，PLGA膜组n=30。除正常对照组外均采用多因素法复制腹腔术后粘连模型，PLGA膜组在盲肠创面贴敷PLGA膜。术后1、2、4、6、12周后打开腹腔，评定腹膜粘连程度，并对盲肠组织行羟脯氨酸水平测定和HE组织病理学观察。 结果 (1) 模型对照组的粘连程度和羟脯氨酸水平均明显高于正常对照组(P＜0.05, P＜0.01)，且PLGA膜组的粘连程度和羟脯氨酸水平均显著低于模型对照组(P＜0.05)。(2) HE染色显示模型对照组盲肠浆膜层有明显的炎症细胞浸润和纤维组织增生。PLGA膜能抑制纤维细胞的增生，炎症细胞浸润减少和胶原纤维明显减少。结论 PLGA膜能抑制成纤维细胞的增生和胶原蛋白的形成，减轻了兔术后粘连发生的程度和范围。

聚乳酸/乙醇酸可吸收医用膜；腹腔粘连；兔

腹部粘连是临床术后常见的并发症和严重的外科问题[1]，不仅给患者带来痛苦，还耗费了大量医疗资源并造成巨大的经济损失。但是，粘连不仅是腹膜应对多种损伤（如创伤、异物、辐射）等有害因素刺激的保护性生理反应[2]，又是一种有害的病理性反应。近来认为引起腹腔粘连的共同途径是纤维蛋白的渗出[3]，且预防腹膜粘连，使受损腹膜出现再上皮化修复是当前外科基础和临床研究的热点。近年来虽然透明质酸、壳聚糖、氧化纤维素等材料相继被研发，但由于降解速率快慢程度、生物抗原性以及材料使用单一等问题，使得这些防粘连效果存在参差不齐的缺点。因而，复合材料的应用将有很好的发展前景，是近来防粘连产品研发的新方向。聚乳酸/乙醇酸（poly（L-lactic/ glycolic acid, PLGA）是由乳酸和乙醇酸聚合而成的可生物降解的医用复合高分子材料，具有较高的生物相容性，其最终降解产物为二氧化碳和水，对生物体并无危害。为此，本实验采用多因素法复制兔腹腔术后粘连模型，观察聚乳酸/乙醇酸可吸收医用膜对预防腹腔术后粘连的作用，为聚乳酸/乙醇酸可吸收医用膜在临床中的应用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

普通级日本大耳白兔66只，体质量为(1.9～2.1) kg，雌雄各半，来源于上虞市星火兔业养殖场[SCXK(浙)2008-0036]，饲养于浙江中医药大学动物实验研究中心兔饲养室[SYXK(浙)2008-0116]，环境温度为(20～22)oC，相对湿度为50%～70%，饲喂全价营养颗粒饲料，自由饮水，12 h/12 h明暗交替。

1.2 材料及试剂设备

聚乳酸/乙醇酸可吸收医用膜(PLGA膜)，乳白色，柔软，规格：50 mm×60 mm×H012，辐照灭菌；由浙江普洛家园生物医学材料有限公司研制；羟脯氨酸(HyP)和蛋白测定试剂盒均购自南京建成生物工程研究所；DU800紫外分光光度计，美国Beckman公司，病理切片设备，美国Microm公司，NIKON H550S倒置显微镜，日本NIKON公司。

1.3 方法

1.3.1 分组及处理

经适应性观察1周后，空腹取兔耳中动脉抗凝血，测定血液学和生化指标，经检测指标无明显异常后，随机分成3组，即：正常对照组6只，模型对照组30只、PLGA膜组30只，其中模型对照组和PLGA膜组分别在术后1、2、4、6、12周时各处理6只，正常对照组于12周时处理6只，雌雄各半。

1.3.2 兔腹部术后粘连模型的制备

按文献[4]采用多因素法复制兔腹部术后粘连模型。术前禁食20 h后，各兔用3%戊巴比妥钠溶液以30 mg/kg耳缘静脉麻醉，待麻醉稳定后仰卧位固定，腹部剃毛和常规无菌消毒后，沿腹正中线纵向切开5 cm，提出盲肠，置于无菌纱布上，使浆膜干燥，使用锉刀在控制损伤面积内(5×3) cm2轻刮盲肠浆膜面10遍，直至控制面积内的盲肠浆膜面轻度点状渗血，再滴3滴无水乙醇于创面，然后用锉刀刮伤对应的双侧腹壁各10下，每侧损伤面积控制在(5×2) cm2以内。回纳盲肠，分两层以1～0号丝线关闭腹腔，消毒创口后放回饲养笼。模型对照组行盲肠和腹壁损伤后即关腹处理，PLGA膜组行盲肠和腹壁损伤后，在关闭腹腔前将(5×3) cm2的PLGA可吸收医用膜平放于盲肠浆膜损伤面上，正常对照组进行假手术处理（行腹部正中切开，不做其它损伤处理）。手术结束后，观察各兔苏醒情况，并在术后肌注青霉素4万单位，连续2 d。

1.3.3 一般情况观察及腹膜粘连程度评分

试验期间观察各组动物的体重、外观体征、行为活动、伤口愈合情况、粪便、尿液以及饮食饮水等情况。并参考Nair[5]制定的五级粘连分级法，将粘连程度分为0～4级，进行目视分级评分：0 级，无任何粘连，分值0分；Ⅰ级，脏器与脏器或脏器与腹壁间有一处粘连带，分值1分；Ⅱ级，脏器与脏器间或脏器与腹壁间有二处粘连带，分值2分；Ⅲ级，脏器与脏器间或脏器与腹壁间有二处以上粘连带，或有肠间粘连，分值3分；Ⅳ级，不论粘连带的多少及程度，脏器直接粘连到腹壁，分值4分。

1.3.4 盲肠壁羟脯氨酸（HyP）含量的测定

取兔的粘连盲肠壁组织，加入9倍冷的生理盐水冲入匀浆管中，在冰水中用匀浆机反复匀浆，制成10%的匀浆液，匀浆后以3 500 rpm离心10 min，取上清液，用生理盐水稀释成1%匀浆。然后用考马斯亮蓝测定组织中蛋白的含量，再用消化法测定组织中羟脯氨酸（HyP）含量，测定方法均按试剂盒说明书操作步骤进行。

1.3.5 盲肠组织 HE染色观察

取粘连盲肠组织一段，10%中性甲醛溶液固定，常规脱水、包埋、切片，行苏木素伊红HE染色，光学显微镜下观察各组实验兔盲肠组织的病理形态结构。

1.3.6 统计学处理

数据采用均数±标准差表示，用SPSS 19.0软件进行统计分析，组间粘连分级和病理组织评分比较采用多个独立样本非参数检验的Kruskal-Wallis H秩和检验和Wilcoxon秩和检验。其它指标先进行方差齐性检验。若方差齐，采用ANOVA单因素方差分析，并采用LSD法行多样本均数间的两两比较。若方差不齐，则改用Dunnett's T3法与Dunnett's C法。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况观察

试验期间，各组实验兔在术中均未出现异常情况，且PLGA膜由于呈白色易识别，放置操作简单、膜柔软并对组织的贴附性好。术后各组实验兔的伤口愈合良好，未见充血、溃疡、渗出及感染化脓等发生，活动正常，口、眼、耳、鼻部无分泌物，但模型对照组兔术后精神略显萎顿、毛色欠缺光泽，进食相对较差，粪便颗粒小且略带稀，体重增重缓慢，至术后3周后症状略有缓解；PLGA膜组术后饮食比模型对照组相对较好，毛色略有光泽并紧贴身体，体重增重比模型对照组好，且在术后4周开始与正常对照组相当。正常对照组术后饮食和体重增重情况均无异常。

2.2 粘连程度评分结果

模型对照组术后1～6周时间点均发生I级以上粘连，部分盲肠与腹壁粘连紧密，粘连带厚实难以剥离，术后12周后粘连程度有所降低；与模型对照组比，PLGA膜组粘连程度有所减缓，甚至无粘连出现，粘连带易分离。各组粘连程度均存在显著性差异(P＜0.01)，模型对照组各时间点粘连程度分值均明显高于正常对照组(P＜0.05)，PLGA膜组各时间点粘连程度分值均明显低于模型对照组(P＜0.05)，见表1。

表1 各组术后粘连程度分值 （x ± s，n=6 ）Tab.1 Comparison of post-surgical adhesion grade in each group

2.3 对盲肠壁组织HyP含量的影响

与正常对照组比，模型对照组实验兔盲肠壁组织HyP含量在术后2周开始明显升高(P＜0.05，P＜0.01)，并在4周时达到峰值；与模型对照组比，PLGA膜组术后2周开始盲肠壁组织HyP含量均明显低

2.4 盲肠组织HE染色观察

HE染色光镜下观察可见，正常对照组的盲肠浆膜面结构正常，无纤维结缔组织增生和炎性细胞浸润(见图K)；模型对照组在术后1周、2周、4周时盲肠浆膜层有大量纤维结缔组织增生，小血管明显增多，成纤维细胞增生活跃，伴有较多的炎性细胞浸润，浆膜层增厚明显(见图A、C、E)，术后6周、12周时仍可见盲肠浆膜层有大量纤维结缔组织增生，小血管明显增加，成纤维细胞增生活跃，但炎性细胞浸润情况相对术后前4周有所减少，并出现重度的胶原化改变(见图G、I)。PLGA膜组盲肠浆膜层纤维组织与血管增生明显减轻，少量的炎性细胞浸润，并且浆膜层增厚程度和胶原化程度均有所减轻(见图B、D、F、H、J)。

表2 各组盲肠组织HyP含量的变化（x ±s，mg/gprot，n=6 ）Tab. 2 Comparison of HyP in cecum tissues in each group (x ± s, mg/gprot, n=6)

图1 各组盲肠组织HE染色结果 （HE×100）Fig. 1 Results of H&E staining in cecum tissue (HE×100)

3 讨论

据报道，术后粘连中因腹部术后形成的粘连所占比重最大，高达80%以上，但出现严重症状的患者不足10%[3,6]。倘若患者出现腹部不适就诊后需要再次腹部手术时，腹腔粘连不仅影响手术的暴露，而且也增加了腹部脏器损伤的危害，容易导致出现更大范围的腹腔粘连。因此，如何预防和避免术后腹腔粘连就显得尤为重要。近来发现术后粘连的发生一般是由于手术操作过程过于粗暴、腹腔积血、炎症感染或异物残留等原因造成的，是多因素、复杂的形成过程。故本试验采用摩擦、牵拉等手术创伤加化学刺激等因素进行多因素造模，复制兔腹腔术后粘连模型，不仅更符合临床实际，而且保证了造模的成功率。结果显示，模型对照组兔腹部术后1周开始就发生明显的粘连现象，且粘连等级相对稳定，基本维持在3分左右，表明该模型成功率高、手术易于操作，方法稳定，无动物死亡现象，观察指标直接、客观，能较好地反映实际情况。

在当前临床中虽然通过提高手术技巧、抗感染和促肠蠕动等处理措施可降低腹腔粘连的发生率，但是防粘连的效果一般。目前普遍认为在临床术中使用屏障隔离物可有效预防腹腔粘连，并被临床医生越来越多地采用。聚乳酸/乙醇酸（PLGA）是一种新型的医用生物材料，研究表明PLGA具有力学性能好，在生理状态下可自行降解，最终分解成为H2O和CO2，其代谢产物对生物体无危害[7-8]，且该材料无细胞毒性和无致瘤性，具有良好的生物相容性[9-10]，并发现PLGA中GA含量越高，共聚物的降解速率越快，PLGA的降解符合本体水解的特征[11]。因此，PLGA材料在临床开发应用上将具有广阔的应用前景，该材料已被美国FDA批准PLGA用于医学使用，包括体内植入[12]。本研究结果显示，PLGA膜组兔的腹腔粘连范围明显比模型对照组少，程度也较轻，表明PLGA膜可减少腹腔粘连的发生率，且PLGA膜在体内2周时就开始部分降解，直至12周时PLGA膜便降解明显，术区肠壁呈透明的薄膜状，降解后崩解成的颗粒基本被组织吸收完全，偶见几粒被肠壁纤维包裹。这与Dinarvand[13]报道的PLGA膜能预防小鼠腹壁和腹膜粘连较为一致。可见，PLGA膜比壳聚糖等单纯材料的降解速率长，能起到隔离创面并能维持相当一段时间的完整性，以充分保证隔离时间，直至创口愈合的优势。

另外，术后粘连的形成还与组织过度修复有关，腹膜受损后渗出的纤维蛋白若未被及时溶解吸收，便会形成纤维蛋白性粘连，随后被成纤维细胞增生取代，不断合成胶原产生胶原纤维，将沉积物纤维化成永久性粘连。羟脯氨酸（HyP）是形成胶原的前体，组织中HyP可反映胶原代谢情况，同时也可反映组织修复愈合程度[14]。结果表明粘连模型对照组的盲肠壁HyP水平显著高于正常对照组，与上述理论相符。PLGA膜组粘连程度、HyP水平均低于模型对照组，说明PLGA膜通过减少胶原过度合成发挥抗粘连作用，同时又不影响损伤的正常修复。同样，HE染色显示，模型对照组术后出现明显的纤维结缔组织的增生以及胶原化程度明显，并有小血管增生明显和大量的炎性细胞浸润，而PLGA膜组只有轻度纤维组织增生并伴有散在炎性细胞浸润，表明PLGA膜具有较好的抗炎作用和抑制成纤维细胞的增殖，促进盲肠壁的修复和保护作用。可见，PLGA膜通过机械屏障隔离作用，可抑制成纤维细胞的增生和胶原蛋白的形成，减轻了兔术后粘连发生的程度和范围，是今后临床上预防腹腔术后粘连理想的生物医学材料。

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Effects of PLGA Absorbable Membrane on Preventing Postoperative Abdominal Adhesion in Rabbits

【Writers】Pang Xiubing1, Pan Yongming2, Hua Fei1, Sun Chaoying1, Chen Liang2, Chen Fangming2, Zhu Keyan2, Xu Jianqin2, Chen Minli2
1 Zhejiang Apeloa Medical Technology Co. Ltd., Dongyang, 322118
2 Laboratory Animal Research Center, Zhejiang Chinese Medical University, Hangzhou, 310053

PLGA absorbable membrane, abdominal adhesion, rabbit

R318.08

A

10.3969/j.issn.1671-7104.2014.05.022

1671-7104(2014)05-0389-04

2014-01-15

浙江省生物可降解医用材料工程技术研究中心项目”(2011E10021)；浙江省卫生高层次创新人才培养工程项目

庞秀炳，高级工程师，E-mail: xb.pang@apeloajiayuan.com

陈民利，教授，E-mail: minlichen01@aliyun.com

【 Abstract 】Objective To investigate the effects of PLGA absorbable membrane in prevention of postoperative abdominal adhesion in rabbits. Methods 66 Japanese white rabbits were randomly divided into three groups: the normal control group n=6, model control group n=30 and PLGA group n=30. Rabbits were received multifactor methods to establish postoperative abdominal adhesion models except for normal control group. The cecum wound was covered PLGA membrane in the PLGA group. At postoperative 1, 2, 4, 6 and 12 weeks, the abdominal cavities were reopened and the adhesive severity was graded blindly, and the hydroxyproline level in cecum tissue was measured and the cecum histopathology was observed. Results (1) the degree of adhesion and hydroxyproline level in model control group were signifcantly higher than those of normal control group (P＜0.05, P＜0.01), while the degree of adhesion and hydroxyproline level in PLGA group were signifcantly lower than those of model control group (P＜0.05). (2) HE staining showed that cecum serosa had obviously infammatory cell infltration and fbroblast proliferation, while PLGA could inhibit fibroblast proliferation and reduce the inflammatory cell infiltration and collagen. Conclusion PLGA absorbable membrane can inhibit fibroblast proliferation and collagen to prevent the experimental postoperative peritoneal adhesions.