羊水来源干细胞骨向分化的研究进展

缪 喆 综 述 史 俊 审 校

·综述·

羊水来源干细胞骨向分化的研究进展

缪 喆 综 述 史 俊 审 校

羊水来源干细胞的属性介于胚胎干细胞与成体干细胞之间，保留有间充质干细胞类似的未分化属性，因无致瘤性、不促发同种异体免疫反应而受到关注。目前，有关其细胞来源及特性、骨向诱导分化及培养，以及在组织工程的应用等方面的研究日益增多。研究认为，羊水来源干细胞的骨向分化有望成为骨缺损修复的新的骨组织来源。本文对羊水来源干细胞骨向分化的研究进展进行综述。

羊水来源干细胞骨向分化组织重建

干细胞包括胚胎干细胞和成体干细胞。胚胎干细胞因为复杂的伦理问题和致瘤性，使其研究受限[1]。成体干细胞，如骨髓干细胞，具有多向分化潜能[2]，可定向分化为多种组织和器官，已有大量的研究对此进行了报道。

Gosden[3]在诊断性羊膜穿刺液中发现大量胚胎及胚胎外组织来源的干细胞，属性介于胚胎干细胞和成体干细胞间的这一干细胞群被命名为人羊水来源干细胞（hAFSC）。在体外诱导hAFSC形成骨组织则是一项重大发现，为hAFSC应用于先天性骨缺损或外伤、肿瘤切除术后骨组织缺损的重建治疗启发新的思考[4]。我们对近年来骨向分化hAFSC的相关研究进展进行综述。

1 羊水及羊水来源干细胞

在胚胎发育第2周，胚泡逐渐形成由上下两胚层组成的胚盘。上胚层近滋养层出现腔内液为羊水的羊膜腔，羊膜腔逐渐扩大使羊膜与绒毛膜融合形成羊膜绒毛膜。在胚胎孕育早期，Na+/Cl-跨母体蜕膜及胎儿皮肤进行主动转运，随之相伴发生水的被动运输，形成与胎儿血浆等渗的羊水；在后期，大量羊水由胎儿排尿形成；此外，胎儿呼吸道分泌液、消化/胃肠道排泄也成为羊水的组成来源。实验已经证明，三胚层来源的胚胎细胞都在羊水中存在。由于羊膜穿刺术的限制，一般在妊娠12周前行羊水抽检[5]。

c-Kit/CD117被认为是干细胞因子受体，从人羊膜穿刺术抽检羊水中分离出约1%的CD117（+）羊水来源细胞，其MHC-I（HLA-ABC）表面抗原呈阳性，部分MHC-Ⅱ（HLADR）表面抗原呈阳性，并表达CD29、CD44、CD73、CD90、CD105等间充质或神经组织干细胞表面标志物[4]。

AFSC能抑制免疫反应与MHC低表达相关[7-8]。Marta等[6]的研究显示，HLA-DR表达阳性hAFSC、HLA-DR表达阴性hAFSC及未经区分hAFSC细胞，均不能诱导同种异体的T细胞免疫反应。但研究同时提及，HLA-DR阳性AFSC能致使局部抗CD3为主的同种异体T细胞发生强烈的增殖。

在Kim等[1]的实验中，hAFSC体外培养至27代，前19代细胞中均呈Oct4阳性表达。Mauro等[10]对羊的羊水来源干细胞的研究显示，AFSC体外培养细胞集落在三维形态上形成球状体，这一过程与其他干细胞及肿瘤细胞一致。

相较其他干细胞，hAFSC具有以下优势[4，9]：①hAFSC的传代时间短，为36 h，并且在250代后仍能保持长端粒及正常染色体组成；②在特定的培养环境中，hAFSC易分化为不同的细胞系；③90%以上的hAFSC表达与未分化状态密切相关的标志物Oct4。

2 羊水来源干细胞的骨向分化培养

将hAFSC以3 000 cells/cm2的密度培养于10%FBS低糖细胞培养基（加青霉素/链霉素、100 mM地塞米松、10 mM β-甘油磷酸、0.05 mM抗坏血酸）[4]，体外培养1周后AFSC-支架复合物移植入免疫缺陷大鼠股骨缺损区。植入8周后，经Kossa染色确认，形成高度矿化组织。植入18周后Micro-CT扫描显示，缺损区密度增高。

Ivana等[11]将未经传代挑选的hAFSC直接进行成骨诱导，在18 d后即有钙化结节形成，30 d后的检测显示，COL1、ONC、OPN、OCN、OPG、BSP、Runx2等骨细胞标志物阳性表达。

Chen等[12]应用原子力学显微镜发现，伴随hAFSC骨向分化，细胞内的粗应力纤维逐渐被成骨细胞内特征性的细肌动蛋白取代，hAFSC杨氏模量也随细胞结构的重建而减小。

3 羊水来源干细胞组织工程支架研究

Li等[13]比较了6种常用组织工程支架PGA、PLGA5050、PLGA8515、PLLA、PCL和PDLLA，提示PLLA支架用于培植AFSC等间充质干细胞有最高的扩散率。

Kim等[9]应用猪膀胱黏膜下胶原基质与PLGA支架组成复合支架系统（BSM-PLGA），作为AFSC骨向分化的支架载体。PLGA的优点是其超微结构易控制，且其降解速度可以预测，能够使降解速度同细胞渗透入新组织的速度相匹配；但PLGA缺少与细胞相兼容的表面结构，限制了细胞滤过及黏附，包括限制生长因子和其他生长信号的分泌，进而影响细胞的生长与分化。猪膀胱黏膜下胶原基质（BSM）是天然的生物活性物质，主要含Ⅰ型、Ⅲ型胶原，其亲水特性使其能够增进细胞的生存、黏附和扩增；但作为骨细胞形成的载体，缺乏必需的支架结构。实验中，给予AFSC-复合支架系统骨向诱导分化，结果显示细胞内成骨关联基因RUNX2、OPN、OCN表达均上调，ALP活性和钙含量增加，呈现出较高的矿化水平。实验提示，这类复合支架系统通过弥补彼此不足，为羊水来源干细胞的骨向分化提供了更合适的微环境，是AFSC骨向分化过程可供选择的组织工程支架。

4 羊水来源干细胞骨向分化的其他诱导物质

应用地塞米松诱导AFSC骨向分化，AFSC支架复合物植入受区后，可能有骨组织缺损、甚至骨折的风险。目前，针对应用其他诱导物质行AFSC骨向分化已作了不同尝试。

BMP是目前发现的唯一具有明确诱导作用，并能异位成骨的细胞因子。Sun等[14]以BMP-7（10%FBS加青霉素/链霉素、50 ng/L rhBMP-7、50μg/L抗坏血酸）分别诱导hAFSC-PLLA复合物和hMSC-PLLA复合物骨向分化。2周后，体外培养hAFSC-PLLA复合物即显现更高的矿化水平，提示hAFSC较hMSC对BMP诱导的骨向分化具有更高的敏感性。

Janz等[15]应用辛伐他汀及地塞米松（α-MEM培养基，含10-6 M辛伐他汀，100 nM地塞米松）为诱导物质，维持24 d，体外诱导hAFSC骨向分化。经RT-PCR分析提取mRNA，确认OCN、OPN均完整表达。

Barba等[16]应用LIM3蛋白（Lim Mineralization Protein 3）诱导hAFSC骨向分化，LIM-3通过抑制KLF基因表达，上调骨特异性转录因子、骨表面标志物基因。LIM-3通过噬菌体转导24 h后，hAFSC细胞内Krupple样因子基因（KLF）表达就显著降低（KLF-2、KLF-4）。hAFSC可能通过TGFβmiR143/145-KLF-4信号通路增加TGF-β的表达，增加BMP2、SMARCC2、Runx2、OP等骨表面标志物的表达水平。

5 羊水来源干细胞骨向分化的应用研究

Steigman等[17]对兔AFSC-PLLA支架复合物行体外骨向诱导分化培养，并设立体外培养14.6周及33.9周两组进行对照。实验中，将幼兔第2~3肋间隙部位的胸骨切除，同时将AFSC-支架复合物植入。术后两个月未见不良反应，Micro-CT扫描示修复区密度明显增高；组织学表现为明显的骨组织形态，移植区边缘骨改建反应活跃；细胞外间质ALP反应活跃。两组对照未发现明显差异。

Turner等[18]亦对兔AFSC-PLLA支架复合物行体外骨向诱导分化培养，19~20周后移植复合物入幼兔鼻骨缺损模型。实验中，相较于无细胞的PLLA支架，AFSC-PLLA支架复合物形成更为连续的矿化骨组织，提示AFSC骨向诱导分化可应用于颌面部骨组织缺损后的重建。

Berardinelli等[19]对羊AFSC-富含Mg的羟磷灰石支架复合物行体外骨向诱导分化培养，21 d后，应用于上颌窦提升术。实验显示，AFMC增加了术后骨组织沉积、加快了血管组织生成反应（细胞扩增速率PI、VEGF表达、VA等均显著提高）。

6 牙髓干细胞骨向分化的应用及其同AFSC的比较

牙髓干细胞（DPSC）的传代时间约为45 h，在30岁以上成人牙髓组织中仅有少量存在[20]。体外培养牙髓干细胞骨向分化除了表达OCN，还表达flk-1（VEGF-R2），使细胞骨与血管组织生成反应增强[21]。Aquino等[22]在第三磨牙拔除术后患者的第二磨牙远中植入DPSC-胶原生物复合体。术后1年，拔牙区骨再生效果显著。

Maraldi等[23]建立“全层颅骨缺损”鼠模型，而后以骨向分化DPSC-胶原支架复合物及AFSC-胶原支架复合物移植入缺损区修复颅骨缺损，实验中通过放射直视影像（RVG）检查，对比修复效果。4周后，相较DPSC修复组，AFSC-胶原支架复合物修复区密度更高，表明AFSC的修复效果更佳。

7 小结与展望

羊水来源干细胞的属性介于胚胎干细胞与成体干细胞之间，保留有与间充质干细胞类似的未分化属性，因其无致瘤性、不触发同种异体免疫反应而受到研究关注，而且不存在明显的伦理冲突；并且较骨髓干细胞处于更少的分化状态，易分化形成不同的细胞系。实验已经证明，体外诱导分化AFSC可形成脂肪细胞、骨细胞、肌细胞、上皮细胞、神经细胞、肝细胞等。AFSC骨向分化的相关研究，未来可能的聚焦方向包括几点，①AFSC的筛选方法：目前自羊膜腔中提取羊水后，大多以流式细胞仪分选间充质干细胞表面标志物（CD29、CD44、CD73、CD105等[24]）阳性的AFSC，以提高细胞纯度。该方法的有效性取决于选取何种表面标志物作为分选标准，而目前的选择标准不尽相同。今后的研究应明确AFSC分选的最优化方案，降低AFSC的应用成本，促进相关研究的深入开展。②明确同种异体骨向分化AFSC移植受区后可能形成的局部免疫反应/机制：已有的报道提示，AFSC可能存在同种异体免疫抑制/促进的特性[6]。明确移植后受区局部免疫反应/机制，是临床应用人同种异体骨向分化AFSC行骨缺损修复的前提和基础。③开展适合AFSC骨向分化细胞支架的研究：适合AFSC骨向分化的细胞支架应具有人为可控的降解速率，使体内降解与新生骨组织生成时间相适宜，且空隙、表面适合骨细胞的分化、形成、增殖。④AFSC骨向分化的最合适诱导物：目前的实验研究显示，骨形成蛋白、辛伐他汀、LIM-3蛋白等均能刺激AFSC骨向分化，但具体机制尚不明确。对其机制和信号通路的研究，有助于探寻AFSC体内诱导分化的最合适诱导物。⑤明确AFSC骨向分化是否可对所有类型骨组织缺损进行修复：AFSC骨向分化细胞是否同时适用于长干骨、扁平骨和不规则骨的骨缺损修复，是今后需要积极开展的，其临床适应证尚待动物模型实验的证实。⑥AFSC与其他干细胞骨向分化的效果比较：目前关于AFSC与其他干细胞成骨研究的比较，主要以修复后的影像学比较为主[24]，关于多种骨向分化干细胞“成骨反应”的速率与形成骨组织的质量、植入受区后局部免疫反应的差异等方面的研究仍有待开展。

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Research Progress on Osteogenic Differentiation of Amniotic Fluid-derived Stem Cell

MIAO Zhe,SHI Jun.College of Stomatology;Department of Craniofacial Surgery,Shanghai Ninth People's Hospital,Shanghai Jiao Tong University School of Medicine;Shanghai Key Laboratory of Stomatology,Shanghai 200011,China.Corresponding author:SHI Jun(E-mail:dr. shijun.oms@gmail.com).

【Summary】Amniotic fluid-derived stem cell is in a medium state between embryonic stem cell and adult stem cell, maintaining undifferentiated property.As not tumorigenic,its stem cell potentiality and immunomodulator properties make it an attractive candidate for cell therapy approaches.Till now,documented reports on the cell origin,characteristics,osteogenic differentiation,cultivation and its tissue engineering application have been raised,regarding the cell lineage as a reasonable source for bone-defect reconstruction.Hereby,a review paper is made to conclude research progress on osteogenic differentiation of amniotic fluid-derived stem cell.

Amniotic fluid-derived stem cell;Osteogenic differentiation;Tissue reconstruction

Q813.1+1

B

1673－0364（2014）05－0279－03

2014年5月12日；修复日期：2014年5月28日）

10.3969/j.issn.1673-0364.2014.05.013

200011上海市上海交通大学口腔医学院，上海交通大学医学院附属第九人民医院口腔颅颌面外科，上海市口腔医学重点实验室。

史俊（E-mail：dr.shijun.oms@gmail.com）。