基因指导下的抗凝治疗

吴岩峰，丁红，刘庆萍，王辉

1 概述

抗凝治疗（anticoagulant therapy）是栓塞类疾病非常重要的治疗手段，涉及临床多个学科。例如，急性心肌梗死的抗凝治疗能够显著降低不稳定心绞痛、非ST段抬高型心肌梗死患者急性期和长期的缺血风险；心房颤动患者的抗凝治疗能够预防心源性卒中；外科术后或妊娠期、产褥期合并深静脉血栓形成的预防等[1-2]。目前临床常用的抗凝药物包括肝素、华法林等传统药物，以及一些新型的口服抗凝药物，如达比加群（dabigatran）、利伐沙班（rivaroxaban）、阿哌沙班（apixaban）等[3]。不同抗凝药物的作用机制及途径各不相同，并且血栓栓塞性疾病的病因不同，结合患者本身的异质性，导致抗凝治疗经常面临着抗凝不足导致致命的血栓形成，抗凝过度导致出血，严重危及生命的风险。因此如何进行个体化的抗凝治疗有着非常重要的临床意义[4]。

随着药物基因组学的发展，近年来药物代谢的基因效应在抗凝治疗个体化管理方面越来越受到重视。本文章就与华法林等抗凝药物治疗效应密切相关的基因研究做一综述，为基因指导下的抗凝治疗做初步探讨。

2 华法林的药物基因组学

2.1 细胞色素P45 0酶 细胞色素P45 0酶（cytochrome P450，CYP450）是一种以血红素为辅基的b族细胞色素超家族蛋白酶，参与药物在肝内降解的第Ⅰ相反应。它由10个家族（1～4、7、11、17、19、21、26）组成，其中1～4家族主要参与药物及外来活性物质的代谢，后6种家族常参与一些重要的内源性物质的生物合成与代谢[5]。涉及药物代谢的细胞色素P450主要为CYP1、CYP2、CYP3家族中的7种亚型：CYP3A4（占P450代谢药物的47%），CYP2D6（28%），CYP2C9（10%），CYP2C19（5%），CYP2E1（4%），CYP2B6（4%），CYP1A2（2%）。其中关于抗凝治疗研究最多的是CYP2C9亚型。CYP2C9★2和CYP2C9★3等位基因最先被发现与华法林的抗凝治疗剂量相关，携带这两种等位基因的个体华法林的起效及维持剂量均小于不携带者[6]。Lal等[7]研究发现携带CYP2C9★2和CYP2C9★3的多态性分别使酶的活性降低30%和80%，携带这两种等位基因的个体服用华法林钠后达到稳态浓度需要的时间较长，具有较低的华法林钠需求剂量，且在使用初期有较高出血危险性。这需要在抗凝治疗过程中减少对CYP2C9★2和CYP2C9★3基因突变个体的华法林钠的使用剂量。CYP2C9基因多态性在不同种族以及地区人群中的分布存在显著差异性[8]。许强等[9]研究发现，在亚洲人群相对于欧美人群对华法林的治疗反应更为敏感，即安全治疗窗更窄，You等[10]研究发现当国际标准化比值（international normalized ratio，INR）值控制在1.8～2.5时，患者的血栓及出血事件发生率最低。而最新的一项Meta分析研究发现，CYP2C9★3对于出血事件的影响在亚洲人群［风险比（hazard ratio，HR）1.88，95%可信区间（confidence interval，CI）1.31～2.69］和高加索人群（HR 1.90，95%CI 1.18～3.05）中相似[11]。这就需要进一步扩大样本量在各种种族及地区人群中加以研究。

近期研究发现，代谢维生素E活性的细胞色素P450酶CYP4F2的基因多态性也能影响华法林的用药剂量。Caldwell等[12]研究表明CYP4F2可解释约2%的华法林剂量个体差异。而在意大利的高加索人群中可解释约6%的华法林剂量个体差异[13]。在中国汉族人群中[14]，CYP4F2 rs2108622位点共检出C和T两种等位基因，CC、TT和CT三种基因型，TT基因型个体所需华法林抗凝维持剂量最高为（4.7±0.99）mg/d，其次是CT基因型为（3.70±0.85）mg/d，最后为CC基因型（2.46±0.75）mg/d。这与国外研究[12]发表TT基因型患者的剂量比CC基因型患者高1 mg/d的结果相近。一项针对华法林长期随访的社区人群研究发现，CYP4F2★3突变个体在3年的随访过程中出血事件显著减少（OR 0.62，95%CI 0.43～0.91），然而并未发现CYP2C9、VKORC1基因多态性与长期随访出血事件的相关性[15]。这可能与既往许多研究仅针对抗凝治疗初始阶段进行观察，随访时间较短有关。

2.2 多药耐药基因 人类多药耐药基因（multiple drug resistance，MDR）（也称ABCB1）主要包括MDRl和MDR3，MDRl起主导作用，MDRl基因定位于7号染色体长臂（7q21.1），互补脱氧核糖核酸（complementary deoxyribonucleic acid，cDNA）全长4669 bp，包含28个外显子，编码1280个氨基酸，表达产物为P糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）[16]。MDR1功能相关的单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms，SNPs）有T129C、C1236T、G2677T/A以及C3435T，其中C3435T位点研究较多。De Oliveira等[17]在巴西人群研究发现，T3435T基因型个体需要的华法林剂量更高43.0（30.8～74.0）mg，其次为C3435T基因型39.0（28.0～49.0）mg和C3435C基因型33.0（23.4～48.5）mg。另一项关于MDR基因多态性单倍体分析的研究也发现，MDR1 2677GG、3435CC组成的单倍体个体需要的醋硝香豆素剂量更小，而携带2677TT/3435TT和2677GT/3435TT个体需要剂量则较多[18]。携带MDR1基因多态性影响华法林代谢的机制可能有以下几个方面[16]：①发生多态后的亮氨酸密码子是稀有密码子，通过影响翻译效率来影响P-gp蛋白的表达；②单个核苷酸的改变影响信使核糖核酸（messenger ribonucleic acid，mRNA）的折叠，从而影响核糖核酸（ribonucleic acid，RNA）的剪接；③与其他功能多态连锁不平衡，真正作用的是其他位点，其只是起到指示作用。

2.3 维生素K环氧化物还原酶复合体1 维生素K环氧化物还原酶（vitamin K epoxide reductase，VKOR）可以使无活性的氧化性维生素K还原为有活性的还原性维生素K，从而使维生素K依赖性凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ及抗凝蛋白C和S不断活化[19]。而华法林正是通过抑制VKOR的活化发挥抗凝作用[19]。编码VKOR的一个重要亚单位基因启动子区存在-1639G/A多态性发生突变则会影响华法林的使用剂量。研究较多的是维生素K环氧化物还原酶复合物1（vitamin K epoxide reductase complex 1，VKORC1）c-1639G＞A多态性。VKORC1基因有10个常见的位于非编码区的SNPs，其中5个高度连锁不平衡的SNP位点与华法林用量的个体差异相关，将这5个SNP位点进行单体型分析，分为A、B两组单体型，A组与华法林低剂量相关，B组与高剂量相关[20]。而在欧洲人中A组单体型的频率为37%～42%，而亚洲人中A组单体型的频率高达85%～89%[20]。在中国人中发现A组单体型的频率为86.9%[21]。在印度人群中[8，22]，VKORC1AA基因型与抗凝治疗剂量效应关系相关，携带AA基因型个体只需较低剂量的华法林即可使INR达标。在加拿大人群中进一步验证了VKORC1基因多态性与华法林的治疗效应相关[23]。因此，VKORC1多态性不仅能解释个体间的用量差异，还能解释亚洲人的平均用量低于欧洲人的原因。最新一项系统综述及Meta分析共纳入22项研究[11]，包括6272例应用华法林治疗的血栓性疾病患者，研究发现VKORC1 c-1639 G＞A（rs9923231）的GA、AA与1个月内华法林治疗过量相关。但并未发现其与出血事件相关，同时未发现在不同种族人群中的差异性。其原因与入选文献所包含的种族来源有关。

2.4 维生素K依赖性γ-谷氨酸基羧化酶 维生素K依赖性γ-谷氨酸基羧化酶（γ-glutamyl carboxylase，GGCX）基因编码的GGCX是一类位于粗面内质网和高尔基体的微粒体膜酶。高加索人群中发现GGCX的内含子中CAA重复序列的增长会降低华法林的敏感性从而使其维持剂量增加[24]。而在非裔美国人群中CAA重复序列的突变率是2.6%（其频率是高加索人群的10倍）[24]。携带这一重复序列的个体也需要较高的华法林维持剂量[24]。这一重复序列导致华法林维持剂量增加的机制并不明确，可能与较高的重复序列增加了相应酶的活性，从而导致凝血因子活化作用增强，进而使得华法林的需求量增加[24]。此外，rs699664、rs12714145等位点也都有一定的研究[24-25]，但其结果并不一致，可能与入选种族、地区或样本量等因素相关。今后需进一步扩大样本量在更广泛的人群中加以研究。

2.5 其他基因多态性 其他可能影响华法林剂量效应关系的基因包括：载脂蛋白E（apolipoprotein E，APOE）基因、微粒体环氧化物水解酶基因（microsomal epoxide hydrolase 1，EPHX1）、炎症细胞因子（inflammatory cytokine gene polymorphisms）基因多态性等。APOE编码的APOE为一个含有199个氨基酸的糖蛋白，它存在于乳糜微粒（chylomicrons，CM）、低密度脂蛋白（low density lipoprotein，LDL）和极低密度脂蛋白（very low density lipoprotein，VLDL）中，对肝脏摄入维生素K有影响。一项关于APOE基因多态性研究共纳入92例接受华法林治疗的患者，其中的46例在83 d内达到华法林稳定浓度，而另外46例则需要更长的时间，他们之间APOE ε3/ε3基因型的差异存在显著性（37% vs 59%， P=0.037）[26]。微粒体环氧化物水解酶是参与外源性化学物质体内生物转化第二时相反应的一种重要代谢酶，其编码的基因是EPHX1[27]。Wadelius等[27]研究发现EPHX1rs4653436多态性与华法林的剂量效应关系相关，与GGCX和血清类黏蛋白2（orosomucoid）基因一起解释约10%的个体差异。炎症细胞因子也被发现与华法林剂量效应关系相关。Yoon等[28]在韩国人群中发现TGFB1、IL1B细胞因子基因多态性能够影响华法林的维持剂量，TGFB1 CC和IL1B TT能够解释48.8%的个体差异性，但其结果有待扩大样本或在其他种族地区人群中进一步验证。

2.6 基因多态性的相互作用及剂量模型的建立华法林药物基因组学正从单基因多态性向多基因多态性联合研究转变，同时研究也发现CYP、MDR、VKOR1等基因多态性可能存在协同作用。Issac等[29]研究发现MDR1C3435T、EPHX1 H139R、PZ A-13G基因多态性并不影响华法林的维持剂量。但是进行交互作用分析时发现，携带MDR1 TT/EPHX1 RH、RR/PZ AA个体与携带MDR1 CC/EPHX1RH、RR/PZ AA个体相比，其维持剂量增加［中位数（25%～75%）：49.0（42.0～59.5）mg/w vs 35.0（24.5～42.0）mg/w]（P=0.014）。此外，除了基因影响华法林剂量差异外，饮食、环境、年龄、性别等也是华法林个体剂量差异的因素。目前，单纯的理论研究正转向基于基因多态性的构建华法林维持剂量群体模型研究。尽管CYP2C9、VKORC1、MDR1、年龄、性别等因素不能完全解释华法林剂量需求的个体差异，但很多研究显示通过CYP2C9、VKORC1、MDR1基因型剂量方程的建立仍然可以提高华法林剂量的准确性，减少经验性用药所带来抗凝不足或过度抗凝的风险，提高个体抗凝治疗安全性。在一项意大利高加索人群研究中[30]，共纳入CYP2C9、VKORC1、CYP4F2、年龄、性别等遗传和非遗传因素探讨对于华法林剂量效应关系的影响，结果发现华法林的剂量受到下列因素的影响，从高到低依次为VKORC1-1639 G＞A（29.7%）、CYP2C9★3（11.8%）、年龄（8.5%）、CYP2C9★2（3.5%）、性别（2.0%）、CYP4F2★3（1.7%），而这些因素能解释58.4%的华法林剂量个体差异。而在一项中国汉族人群中的研究中[31]，共入选VKORC1、CYP2C9、GGCX、EPHX1、APOE5种基因多态性，其中与华法林稳定剂量相关的有VKORC1、CYP2C9和GGCX，多元回归分析提示对华法林用量个体差异有显著影响的因素有年龄、体重、VKORC1、CYP2C和GGCX，该模型可解释华法林稳定剂量个体差异57.8%的原因。VKORC1、CYP2C9、GGCX、年龄、体重对华法林用量个体差异的贡献分别是30.2%、22.8%、1.5%、4.7%和6.7%。Ozer等[32]在一项研究中纳入土耳其高加索人群患者，并检测了CYP2C9、VKORC1、CYP4F2（rs2108622）和EPHX1（rs2292566）多态性，结果发现CYP2C9、VKORC、CYP4F2以及年龄入选回归方程，能够解释39.3%剂量个体差异。既往预测模型的建立都提示遗传因素是影响华法林个体间用量差异的主要因素，华法林稳定剂量预测算法可提高临床上华法林使用的有效性和安全性。

3 新型口服抗凝剂的药物基因组学

新型的口服抗凝药物包括达比加群、利伐沙班、阿哌沙班等，其主要机制是直接作用于凝血因子，抑制凝血酶或Ⅹa因子而起到抗凝作用。达比加群酯是一种新型的合成的直接凝血酶抑制剂，是达比加群的前体药物，属非肽类的凝血酶抑制剂。口服经胃肠吸收后，在体内转化为具有直接抗凝血活性的达比加群，适用于有非瓣膜性心房颤动患者中减低卒中和全身栓塞的风险。最新的长期抗凝治疗的随机评价（Randomized Evaluation of Longterm Anticoagulation Therapy，RE-LY）试验中[33]，Paré等对2944例受试者进行全基因组关联分析（genome-wide association，GWAS）。研究的主要安全结局是任何原因的出血（包括大出血和轻微出血），其中1490例有达比加群药物浓度数据。对达比加群峰谷浓度进行基因组关联分析发现肝羧酸酯酶1（carboxylesterase 1，CES1）基因单核苷酸多态性rs2244613与达比加群谷浓度相关，ABCB1基因SNP rs4148738和CES1基因SNP rs8192935与峰值浓度相关。在受试者中，CES1基因SNP rs2244613的每一个次要等位基因与较低的谷浓度相关（每个等位基因降低15%），有较低的出血风险，也有减少大出血风险趋势但无统计学差异。华法林与达比加群的相互作用与携带状态明显相关，次要等位基因携带者服用达比加群治疗要比华法林治疗出血风险小，而对于非次要等位基因携带者两药出血风险无差别，其与缺血事件无关。SNP rs4148738和rs8192935与出血或缺血事件均无关。该研究得出结论携带CES1 rs2244613次要等位基因的患者占32.8%，可降低达比加群活性代谢物的作用时间，携带该基因多态性则出血风险较低。这就提示常规基因分型有助于临床进一步权衡达比加群剂量，从而实现个体化治疗，进而在药物安全性和有效性达到平衡[34]。利伐沙班是一种高选择性、直接抑制因子Ⅹa而中断凝血瀑布的内源性和外源性途径，抑制凝血酶的产生和血栓形成[3]。利伐沙班主要通过CYP代谢，因此CYP相关亚型[35]，尤其是CYP3A4/5和CYP2J2相关编码基因多态性的变化可能影响其代谢。此外与达比加群相类似，利伐沙班是P糖蛋白的代谢底物，ABCB1基因多态性可能也影响利伐沙班的抗凝剂量效应关系及出血风险。阿哌沙班通过高选择性直接抑制Ⅹa因子来抑制凝血酶和血栓形成，因其无需抗纤维蛋白酶辅助，对Ⅹa因子的抑制更加彻底[3]。阿哌沙班也是通过CYP代谢，因此CYP相关编码基因可能与其抗凝效应相关。由于新型口服抗凝剂尚未广泛实用，相关药物基因组学研究并不多，今后仍需在更大人群中加以研究，以探讨基因在抗凝治疗中的作用。

总之，随着药物基因组学的研究进展和华法林等抗凝药物药理作用分子机制的逐步阐明，全基因组关联研究的发展，会有越来越多的关联基因在不同种族和地区人群间被发现。而随着外显子及全基因组测序技术的应用，一些新的基因和突变位点将会被确认[36]，从而使接受华法林等抗凝药物治疗的个体药物基因组学更为精确，用药更为合理，真正达到个体化治疗的目的。

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【点睛】

抗凝药物的基因组学影响抗凝治疗的剂量效应关系，可以为急性冠状动脉综合征、心房颤动、静脉血栓形成、肺栓塞等栓塞类疾病的个体化治疗提供依据。