酪蛋白糖巨肽对小鼠腹腔吞噬细胞及肠黏膜免疫细胞的影响

叶 雷，陈庆森，李 伟，阎亚丽，赵 培，庞广昌，胡志和

酪蛋白糖巨肽对小鼠腹腔吞噬细胞及肠黏膜免疫细胞的影响

叶 雷，陈庆森*，李 伟，阎亚丽，赵 培，庞广昌，胡志和

（天津市食品生物技术重点实验室，天津商业大学生物技术与食品科学学院，天津 300134）

目的：由于酪蛋白糖巨肽（casein glycomacropeptide，CGMP）具有许多生理活性功能和独特营养特性，研究CGMP对小鼠腹腔免疫细胞以及肠黏膜屏障的影响可为其应用于保健食品和医药品提供科学依据。方法：以96只健康昆明雌性小鼠为实验动物，利用流式细胞仪、HE染色和免疫荧光标记技术，分别检测分析了灌胃不同剂量的CGM P（30 μg/d和120 μg/d）对实验小鼠腹腔吞噬细胞吞噬活性以及肠上皮内淋巴细胞（intraepithellal lymphocytes，IEL）和固 有层IgA+浆细胞数量的影响，探讨CGMP改善小鼠腹腔吞噬细胞和肠黏膜屏障功能的作用。结果：CGMP能够显著增加小鼠腹腔吞噬细胞的吞噬能力，灌胃时间越长，作用效果越明显；其中灌胃CGMP的剂量为120 μg/d的作用效果优于30 μg/d剂量组。且与对照组相比，灌胃CGMP组小鼠十二指肠上皮内淋巴细胞数和固有层IgA+浆细胞数量显著增加（P ＜ 0.01）。结论：CGMP可以增强小鼠腹腔吞噬细胞吞噬功能，诱导肠道黏膜免疫应答，增强肠黏膜免疫屏障功能，有望开发为抑制肠道炎症的功能性食品添加剂。

酪蛋白糖巨肽；肠黏膜屏障；吞噬细胞；肠上皮内淋巴细胞；IgA+浆细胞

近年来，随着对炎症性肠病（inflammatory bowel disease，IBD）、多脏器功能衰竭、细菌移位、肠源性感染等研究的深入，人们对肠道复杂生理功能有了新的认识，注意到肠道不仅是消化和吸收营养物质的重要脏器，而且还具有其他功能，如免疫调节、内分泌功能、黏膜屏障功能。不论肠道的原发 性病变，还是继发性损害，均会造成肠功能不同程度的损伤。当前临床研究的热点主要是肠黏膜屏障功能（gut barrier function），肠道黏膜屏障是存在于肠道内的具有高效选择性功能的屏障系统[1]，由肠黏膜非特异免疫屏障和肠黏膜特异性免疫屏障组成[2]，它在保护机体免受食物抗原、防御微生物及其产生的有害代谢产物的损害、保持机体内环境的稳定方面起重要作用[3]。肠黏膜是食物进入肠道后最先接触的部位，食物经过胃肠道的消化和营养吸收，使得小肠暴露在大量抗原中[4-5]，食物中已有的或经过胃肠道消化产生的免疫活性肽，调节着肠黏膜免疫屏障，使其处于正常的生理状态。目前，发现许多肠道疾病都会引起肠黏膜屏障功能的变化，如急性肠炎、肠易激综合症、溃疡性结肠炎等[6]。因此，饮食对于维持肠道最佳的免疫功能起着重要作用[5,7]，通过食疗的方法改善肠道屏障功能成为可能。

1965年，Delfour等[8]发现κ-酪蛋白的特定位点经凝乳酶切断，生成不溶的副κ-酪蛋白和三氯乙酸可溶的亲水性酪蛋白巨肽两部分。目前，Kim等[9]已经通过基因工程改造酵母细胞，使其能够产生人体酪蛋白巨肽（human caseinomacropeptide，hCMP）。这些可溶性多肽含有较多的糖链，于是被称为糖巨肽（glycomacropeptide，GMP），而酪蛋白来源的此类多肽都统称为酪蛋白糖巨肽（caseino-glycomacropeptide，CGMP）。它是乳清中重要的一种活性多肽，是由64 个氨基酸组成，含有较多的支链氨基酸（branched chain amino acid，BCAA），而缺少芳香族氨基酸的特殊结构。对于CGMP的制备工艺，目前常用的制备CGMP的方法有沉淀法[10]、双水相法[11]、酶交联法[12]以及层析法[13]。其中，沉淀法会引起部分蛋白质变性；双水相法和酶交联法制备成本高；层析法吸附率高，并且不会引起蛋白质变性，因此适用于大规模生产。前期实验通过离子交换层析的方法，采用价格较低的强碱性苯乙烯系阴离子交换树脂从乳清粉中分离CGMP，并对分离过程中的工艺条件进行优化，寻找了一条过程简单、成本较低、纯化效果较好、唾液酸含量高的CGMP制备的工艺路线[14]。

通过对CGMP的结构分析，发现CGMP中主要以O-糖苷结合2 种中性糖链和3 种酸性糖链，90%以上的结合糖链都含唾液酸[15]。结构决定性质，CGMP的特殊氨基酸组成和配糖体，决定了其对机体能够产生一系列的生物学活性[16-19]，如果将CGMP中的唾液酸消化掉，则许多生物学活性就会减弱或消失。目前，CGMP作为保健营养品（nutraceuticals）引起了科研工作者越来越多的兴趣。Yun等[20]通过研究CGMP对脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）刺激的脾脏细胞产生免疫球蛋白的影响，发现CGMP诱导IgA的浓度升高，说明CGMP能够促进正常机体B淋巴细胞的增殖，上调机体的体液免疫功能。Li等[21]于2004年通过体外实验发现CGMP能够增加人的吞噬细胞U937的吞噬活性，并且能够促进其增殖。另外，贾玉臣等[22]研究发现，乳源CGMP诱导调节CD4+细胞的活性，能够促进小肠上皮的弥散性和促炎细胞因子如IFN-γ、IL-4等的增加。

综上所述，寻找并研究一些食源性生物活性物质，在维持机体肠黏膜免疫系统的平衡以及新药和保健品的研制和开发方面具有重要价值。因此，本实验利用流式细胞仪、石蜡切片苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色和免疫荧光技术，检测分析CGMP对小鼠腹腔吞噬细胞吞噬活性以及十二指肠上皮内淋巴细胞（intraepithelial lymphocyte，IEL）和固有层IgA+浆细胞数量变化的影响，探讨CGMP对小鼠腹腔免疫细胞和肠黏膜免疫系统的影响，这为CGMP作为功能性食品添加剂以及新药的创制提供可靠的科学依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

6 周龄昆明雌性小鼠96 只，SPF级，体质量（25.53±1.65）g，由中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心提供。

1.2 材料与试剂

牛乳源CGMP 新西兰Tatua公司；啤酒酵母 天津商业大学菌种保藏室；异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）、二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO） 美国Sigma 公司；多聚赖氨酸天津华生生物科技有限公司；二甲苯（分析纯） 天津市佳兴化工玻璃仪器工贸；苏木精染液、伊红染液 天津市久圣医疗电子仪器有限公司；所用试剂均为分析纯。

1.3 仪器与设备

FACS Calibur流式细胞仪（双激光配置） 美国BD公司；MODULYOD-230冷冻干燥机 郑州长城科工贸有限公司；YD-355电脑切片机、TD-B组织烤片机、YD-A组织摊片机 金华市益迪医疗设备厂；DS-5MC光学显微镜、TE2000荧光显微镜 日本Nikon公司。

1.4 方法

1.4.1 实验动物及分组

表1 实验动物分组Table 1 Grouping of mice in experiments

6 周龄小鼠适应性喂养2 周后根据体质量将小鼠随机分为3 组，随后按照表1所示的分组和灌胃剂量分别对小鼠进行连续灌胃，并在实验开始2、4、6、8 d后分别在各组中随机选取8 只小鼠进行腹腔吞噬细胞吞噬活性和肠道免疫细胞活性的研究。实验期间，各组小鼠自由采食、饮水。

1.4.2 不同剂量的CGMP对小鼠腹腔吞噬细胞吞噬活性的影响

1.4.2.1 啤酒酵母培养和酵母干粉的制备

将活化后的啤酒酵母接种到土豆平板培养基，28 ℃培养3 d，3 mL无菌水轻轻冲洗获得酵母细胞，将收集的酵母细胞500 r/min离心1 min，弃去沉淀，上清液8 000 r/min离心1 min获得大小均一的酵母细胞。无菌水悬浮后－20 ℃冷冻，最后置于冷冻干燥机中制成冻干粉，4 ℃干燥保存。

1.4.2.2 小鼠血清的制备

眼球摘除法取血，室温静置30 min，4 ℃静置2 h，3 000×g、4 ℃离心10 min获得小鼠血清，分装后，－80 ℃贮存，作为荧光标记啤酒酵母细胞的调理素。

1.4.2.3 荧光标记啤酒酵母细胞

取120 mg啤酒酵母冻干粉，与6 mL 0.01 mol/L的无菌磷酸盐缓冲溶液（phosphat buffered saline，PBS）缓冲液溶解混匀后，80 ℃水浴加热15 min灭活。将灭活后的菌体细胞8 000 r/min离心2 min，弃上清液，将得到的沉淀用6 mL DMSO配制的FITC溶液（0.1 mg/mL）悬浮混匀，室温避光孵育1 h，离心后去上清液，无菌PBS洗涤沉淀4 次，得到荧光标记的酵母细胞。

1.4.2.4 啤酒酵母细胞荧光标记率的检测

利用流式细胞仪检测荧光标记酵母的标记率，荧光标记率大于99.9%的说明标记合格，最后将得到的荧光标记合格的酵母细胞用无菌PBS调整至终浓度为2×109个/mL菌悬液，4 ℃避光保存备用。在进行吞噬实验前将荧光标记啤酒酵母细胞悬液与小鼠血清按照体积比为1∶1的比例室温孵育60 min，无菌PBS调整至终浓度为1×109个/mL。

1.4.2.5 小鼠腹腔吞噬细胞的分离与吞噬

颈椎脱臼处死各组小鼠，用75%的酒精涂抹腹部，向腹腔注射5 mL的无菌PBS，轻揉腹部1～2 min后，剪开腹部，吸取3 mL腹腔液于离心管中，1 000 r/min离心5 min，弃上清，加入0.5 mL的PBS混匀，然后加入50 μL上述制备好的荧光标记的酵母细胞，使其中荧光酵母和吞噬细胞个数比为20∶1。混匀后倒入24 孔培养板中，置于37 ℃恒温箱中孵育40 min，弃去孔内液体，加入4 ℃预冷的PBS溶液0.5 mL，轻轻晃动冲洗1 次，然后再加入0.5 mL、4 ℃预冷的PBS抽吸吹打，混匀后置于冰上待测。

1.4.2.6 流式细胞术检测不同剂量的CGMP对小鼠腹腔吞噬细胞吞噬功能的影响

利用流式细胞仪检测每个分组中8 只小鼠吞噬细胞样本的吞噬活性，每份样本获取10 000 个细胞。以前向散射角（forward scatter，FSC）和侧向散射角（side scatter，SSC） 建立FSC-SSC点图，设“门”以圈定待测的吞噬细胞群，检测“门”内吞噬细胞的FITC荧光强度，获取FL1-H荧光信号柱状图。利用Cell Quest program 6.0对获取的细胞数据进行分析，首先以未加荧光标记酵母细胞的吞噬细胞样品作为阴性对照，设“门”M1表示没有吞噬荧光标记酵母的吞噬细胞群；接着以荧光标记的酵母细胞为阳性对照，上机检测，获得FL1-H荧光信号柱状图并记录其平均荧光强度（M）；然后以此平均荧光强度M作为一个标准单位，按照此标准单位的倍数依次设门M2、M3、M4……Mn，分别表示吞噬1、2、3……n-1个荧光标记酵母细胞的吞噬细胞群。最后根据设“门”的个数来确定n值，并按照式（1）计算吞噬细胞的吞噬率。

式中：M1代表M1门内的细胞数，即没有吞噬酵母的吞噬细胞数。

按照式（2）计算吞噬指数。

式中：M2代表M2门内的吞噬细胞数，即吞噬1 个酵母细胞的吞噬细胞个数；Mn代表Mn门内的吞噬细胞数，即吞噬n－1个酵母细胞的吞噬细胞数。

1.4.3 不同剂量的CGMP对小鼠十二指肠上皮内 淋巴细胞和固有层IgA浆细胞的影响

1.4.3.1 小鼠十二指肠组织的固定

各组小鼠颈椎脱臼处死后迅速取胃下5 cm处十二指肠组织2 cm，放入包埋盒中，做好标记，置于4%的福尔马林溶液中固定48 h。

1.4.3.2 小鼠十二指肠组织石蜡切片的制备和HE染色及IEL计数

参照文献[23-24]中的方法制备各组小鼠十二指肠组织的石蜡切片以及HE染色。

在每张HE染色切片上，随机选择10个视野进行计数，每个视野内单核的非上皮细胞被认为是淋巴细胞，统计肠IEL数。

1.4.3.3 免疫荧光标记及计数

1）将上述制备的常规石蜡切片脱蜡至水。2）抗原修复：将洗涤后的组织切片放入加热煮沸后的柠檬酸钠（pH 6.0）抗原修复液中，中火加热20 min，冷却至室温，取出组织切片放入PBS缓冲液中室温孵育10 min。3）荧光标记：将2 mg/mL的FITC-IgA单抗溶液与pH 7.4的PBS溶液按照1∶50（V/V）倍进行稀释；将稀释的单抗溶液滴加到切片组织上，37 ℃恒温孵育2 h进行荧光标记。4）封片：取出切片组织，PBS浸洗3 次，每次10 min；擦去载玻片上多余的水分，滴加甘油进行封片。5）镜检计数：荧光显微镜对组织切片中IgA+细胞进行计数，每张切片随机计数10 个视野。

1.5 数据分析

用SPSS11.5对数据进行方差分析和t检验分析，校验水平为α=0.05；其中，P＜0.05表示差异显著，P＜0.01表示差异极显著；数据用±s表示。

2 结果与分析

2.1 不同剂量的CGMP对小鼠腹腔吞噬细胞吞噬活性的影响

2.1.1 不同剂量的CGMP对小鼠腹腔吞噬细胞吞噬指数的影响

图1 不同剂量CGMP对吞噬细胞吞噬指数的影响Fig.1 Effect of different doses of CGMP on phagocytic index of phagocytes

由图1可知，实验期间灌胃CGMP组（G1和G2）小鼠腹腔吞噬细胞的吞噬指数随着灌胃天数的增加而增大，并且在灌胃第6天G2组小鼠吞噬细胞的吞噬指数显著高于G1组（P＜0.01），两个剂量组小鼠都在灌胃第8天吞噬细胞的吞噬指数达到最大值；而在灌胃第2天和第4天，G1和G2组与对照组G0相比小鼠腹腔吞噬细胞的吞噬指数差异并不显著（P＞0.05）；但从灌胃第6天开始，G2组吞噬指数显著高于G0组（P＜0.01）；第8天G1和G2组小鼠吞噬细胞吞噬 指数与对照组相比均显著升高（P＜0.05，P＜0.01）。

2.1.2 不同剂量的CGMP对小鼠腹腔吞噬细胞吞噬率的影响

图2 不同剂量的CGMP对腹腔吞噬细胞吞噬率的影响Fig.2 Effect of different doses of CGMP on phagocytic rate of phagocytes

由图2可知，在灌胃第2天，G1和G2组与G0组相比小鼠吞噬细胞的吞噬率均升高，其中G2组与G0组相比差异显著（P＜0.05）；灌胃第4天， G1和G2组小鼠吞噬细胞吞噬率降至最低，且与G0组无显著差异，随后升高，并在第8天升至最高值。另外，从灌胃第6天开始，G2组小鼠吞噬细胞吞噬率显著高于G0和G1组（ P＜0.05）；而在灌胃第8天，G1和G2组小鼠吞噬细胞吞噬率均显著高于G0组（P＜0.05），且G2组小鼠腹腔吞噬细胞吞噬率也显著高于G1组（P＜0.01）。

2.2 不同剂量的CGMP对小鼠十二指肠IEL的影响

图3 不同剂量的C GMP对小鼠肠上皮内淋巴细胞数量的影响Fig.3 Effect of different doses of CGMP on the number of IEL in mice

由图3可知，从灌胃第2天开始两个剂量的CGMP都能显著增加小鼠十二指肠IEL的数量（P＜0.01）；并且随着灌胃天数的增加，G1组小鼠十二指肠IEL数量也随之增加，在第8天达到最大值，而G2组小鼠十二指肠IEL数量于第4天达到高峰，随后则无显著增加。

2.3 不同剂量的CGMP对小鼠十二指肠固有层中IgA+浆细胞的影响

图4 不同剂量的CGMP对小鼠固有层IgA+浆细胞数量的影响Fig.4 Effect of different doses of CGMP on the number of IgA+plasma cells in mice

由图4可知，从灌胃第2天开始，两个剂量的CGMP都能显著引起小鼠十二指肠固有层中IgA+浆细胞数量的增加（P＜0.01），且随着灌胃时间的延长IgA+浆细胞数量也不断增加，在第8天达到最大值。

3 讨 论

3.1 建立流式细胞仪检测腹腔吞噬细胞吞噬活性方法的目的和意义

腹腔吞噬细胞能够非特异性的吞噬进入人体内的病原体，衰老病变细胞，参与抗原识别与递呈，生成多种细胞因子，对于机体抵御病原体的入侵起着重要的作用。因此，检测腹腔吞噬细胞的吞噬活性对于药物的筛选和功能性食品的开发具有重要的意义。然而，传统的检测吞噬细胞吞噬活性的方法如鸡红细胞和酵母细胞的吞噬实验具有耗时长、受人的主观因素影响比较大、观察的数量较少等缺点。采用流式细胞仪来检测吞噬细胞活性不仅灵敏快速，而且高通量检测的特点很大程度上提高了检测效率，减少了人 为主观因素的影响，所以该方法受到了人们的广泛关注，随之发展起来的技术方法也很多。李煜等[25]通过流式细胞术检测小鼠腹腔吞噬细胞吞噬荧光微球的 活性，并与传统的鸡红细胞法作比较，虽然吞噬荧光微球的方法检测效果较好，但是检测成本相对高昂；而黄琼[26]和金齐 力[27]等分别通过吞噬荧光标记大肠杆菌和结核分枝杆菌的方法检测了吞噬细胞的吞噬活性，但是由于这些细菌的细胞较小容易被吞噬细胞表面受体黏附且荧光标记率低，从而影响检测结果的准确性。

Miliukienë等[28]2005年通过吞噬荧光标记啤酒酵母的方法来检测外周血中中性粒细胞 的吞噬活性，但是由于没有排除未标记的酵母细胞对实验的影响造成检测结果误差较大。因此本实验在总结前人的研究经验基础上对检测方法进行了相关改进，使其更能够准确反映吞噬细胞的吞噬活性。将啤酒酵母细胞作为吞噬颗粒，这是因为其细胞比较大，菌体大小差别小，同时，FITC荧光标记率高，可以达到99.97%，这为后续研究的准确性提供了基础。另外，利用流式细胞仪的高通量特点进一步提高了研究的准确性和可信度。因此，在本实验结合流式细胞术建立了一种具有灵敏快捷、重复性好、准确率高等优点的检测吞噬细胞活性的方法，并运用该方法评价了不同剂量的CGMP对小鼠腹腔吞噬细胞吞噬活性的影响。

3.2 CGMP对小鼠腹腔吞噬细胞吞噬活性的影响

吞噬细胞包括中性粒细胞和单核-吞噬细胞，这些细胞是执行固有免疫作用的效应细胞，可及时清除入侵体内的病原微生物，在机体早期抗感染免疫过程中发挥重要作用。吞噬细胞不仅参与机体的特异性免疫反应和非特异性免疫反应，而且是两种免疫反应联系的“桥梁细胞”，在与多种病原微生物识别与结合过程中，它可以诱导I-A抗原的高表达，能够通过受体与病原体等抗原异物的结 合作用来主动吞噬、杀伤和消化病原微生物并分泌多种细胞因子。研究发现，吞噬细胞吞噬内毒素是体内清除内毒素的主要途径，当吞噬细胞的吞噬功能受到抑制，导致体内清除内毒素或病原微生物的功能减弱，会引起机体抵抗能力下降[29]。因此吞噬细胞在调节和维持腹腔环境的稳定，增强固有免疫方面具有关键作用。

Stutas等[30]发现，κ-酪蛋白经胃蛋白酶和胰蛋白酶消化产生的多肽能够显著提高促丝裂原诱导的人淋巴细胞的增殖；而且来源于κ-酪蛋白的胰蛋白酶酶解产物Phe-Phe-Ser-Asp-Lys在体外能够促进抗体的产生并且增强鼠和人吞噬细胞的吞噬活性。另外，Li等[21]在体外通过CGMP与人吞噬细胞U937作用，发现低剂量的CGMP能显著增强吞噬细胞的吞噬活性并促进其增殖。而在本实验中，我们通过动物实验，发现G1和G2组小鼠吞噬细胞的吞噬指数和吞噬率呈剂量-效应和时间-效应关系；而G1和G2组吞噬指数于灌胃第8天显著接近且都高于G0组，这可能是因为灌胃8 d后G1和G2组小鼠吞噬细胞的吞噬能力均增加到最高，所以造成剂量效应无显著差异；另外，G1和G2组小鼠的吞噬率于灌胃第4天出现低谷且与G0组无显著差异，这可能是因为灌胃前期CGMP对吞噬能力的正向调节作用有所抑制，而在吞 噬指数的影响实验中也可以看到相似的实验结果，即在灌胃前期吞噬指数的增加不显著；因此，在体内CGMP同样能够显著增强腹腔吞噬细胞的吞噬能力，而且随作用时间的延长作用效果越明显，这与Li等[21]的体外研究结果基本一致。

3.3 CGMP对小鼠十二指肠IEL的影响

肠黏膜免疫屏障主要由肠道相关淋巴组织构成。肠上皮内淋巴细胞是黏膜免疫的主要效应位点，淋巴细胞归巢的主要部位，在诱导和调节肠黏膜免疫应答中起着重要作用。IEL是肠黏膜免疫系统中最先接触抗原的免疫活性细胞，它长期与肠道正常菌群、病原微生物接触，在肠黏膜的抗感染免疫、保持肠上皮细胞的完整性及调节对外来抗原的免疫应答方面均有重要作用。发生IBD时，肠黏膜的天然免疫和特异性免疫系统均有免疫异常的表现，而淋巴细胞参与的IBD异常免疫主要为特异性（适应性）免疫反应。现在认为，肠黏膜免疫系统对肠腔常驻菌群的耐受异常是IBD发病机制的原因之一[31]。因此，IEL对于维持肠黏膜的免疫耐受方面起着重要作用，通过调节IEL来达到增强IBD患者对肠道菌群的 免疫耐受性可能是改善或者治疗IBD的重要方法。本实验结果表明CGMP可能具有这方面的功能，但仍需要进一步的研究进行验证。另外，CGMP诱导IEL的显著增加可能的途径是CGMP由肠上皮M细胞传递给PP结内的树突细胞，刺激PP结T淋巴细胞增殖，通过肠系膜淋巴结到达黏膜免疫的效应位点，主要是CD8+细胞；CD8+细胞为杀伤性T细胞，通过与肠上皮细胞的相互作用和细胞因子的分泌，从而能够维持肠黏膜机械屏障和免疫屏障功能，抵御肠道中的毒素和病原微生物的侵袭[11]。因此，本研究表明了CGMP在维持肠黏膜免疫屏障方面具有重要作用，长期灌胃CGMP能够诱导IEL的数量增加，这也提示CGMP可能具有诱导肠黏膜产生获得性免疫应答作用。

3.4 CGMP对十二指肠固有层内IgA+浆细胞的影响

小肠固有层是肠黏膜免疫的效应位点，固有层IgA浆细胞分泌的sIgA进入肠腔，对维持局部抗体的有效水平，抵御肠道病原微生物的侵袭，拮抗细菌定殖、黏附，以及中和肠腔毒素等方面均起重要作用。本实验的结果表明，CGMP能够诱导小鼠十二指肠固有层IgA+浆细胞数量的增加。CGMP能够诱导小鼠十二指肠固有层IgA+浆细胞数量的增加的可能机制包括以下几个方面：首先是CGMP干预后，肠道菌群发生变化尤其是肠道益生菌如双歧杆菌数量显著增加的结果[32]；其次，也可能是由于CGMP通过PP结的M细胞进入黏膜淋巴组织后，经APC加工递呈给B细胞，在T细胞和细胞因子，尤其是TGF-β影响下发生 IgM-IgA类型转换，然后经传出淋巴管迁移到肠系膜淋巴结（mesenteric lymph node，MLN），随后分裂和分化，最后离开MLN，经胸导管进入血循环，在归巢受体介导下迁移至肠黏膜固有层，分化为成熟的IgA+浆细胞，促使固有层IgA+浆细胞的增加[15]；然后，可能由于CGMP直接通过肠道上皮层进入固有层，刺激CD4+T淋巴细胞分泌细胞因子，促使IgA+浆细胞的分化[15]。最后还有一种可能，由于肠黏膜固有层免疫应答以Th2型为主，CGMP可能直接通过肠道固有层的树突细胞的捕获进入固有层，通过与Th2淋巴细胞的相互作用，促使Th2细胞可分泌多种细胞因子如TGF-β、IL-4、IL-5、IL-6及IL-10，IL-6可协同诱导固有层中的sIgA+B细胞分化成为IgA+浆细胞[22]。因此，本研究的结果提示CGMP能够诱导肠黏膜产生获得性体液免疫应答，这为开发CGMP作为黏膜疫苗的载体或佐剂来诱导局部黏膜免疫反应来提高分泌进入肠腔的sIgA量，从感染的源头阻止病原菌的侵入提供了有力的科学依据。

4 结 论

本实验建立了一种新的利用流式细胞仪测定吞噬细胞吞噬活性的方法，该方法具有灵敏、快捷、重复性好准确率高的优点。通过该方法检测灌胃不同剂量CGMP小鼠腹腔吞噬细胞的吞噬能力发现：CGMP能够显著增强吞噬细胞的吞噬能力；而且灌胃剂量为120 μg/d时的作用效果优于灌胃剂量为30 μg/d时的作用效果；另外，灌胃时间越长，CGMP对吞噬细胞吞噬能力的作用效果越明显。因此，这提示CGMP可以作为功能性食品添加剂，增强机体的非特异性免疫细胞的功能。

实验发现小鼠灌胃CGMP后，小肠黏膜免疫反应的效应位点中肠上皮内淋巴细胞和固有层IgA+浆细胞数量与对照组相比显著增加（P＜0.01），这说明CGMP能够诱导小鼠肠上皮内淋巴细胞和固有层IgA+浆细胞的增加。因此，CGMP可以作为功能性食品添加剂诱导肠黏膜体液免疫反应，从而分泌多种抗炎因子以增强肠道的抗炎作用。

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Effect of Casein Glycomacropeptide on Phagocytic Cells and Intestinal Mucosa Immune Cells in Mice

YE Lei, CHEN Qing-sen*, LI Wei, YAN Ya-li, ZHAO Pei, PANG Guang-chang, HU Zhi-he
(Tianjin Key Laboratory of Food Biotechnology, College of Biotechnology and Food Science, Tianjin University of Commerce, Tianjin 300134, China)

Objective: Casein glycomacropeptide (CGMP) has many physiological functions and unique nutritional properties. This study aimed to explore its effect on peritoneal immune cells and intestinal mucosal barrier in mice. Methods: After being intragastrically given CGMP at doses of 30 and 120 μg/d, respectively, 96 female Kunming mice were tested for phagocytic activity, intestinal intraepithelial lymphocytes (IEL) subpopulations and the number of IgA+plasma cells in the lamina propria by flow cytometry, hematoxylin and eosin (HE) staining and immunofluorescence, respectively. Results: CGMP administration to mice resulted in a significa nt increase in phagocytic activity in a dose- and time-dependent manner. Compared with the control group, CGMP administration also resulted in a significantly higher percentage of intraepithel lal lymphocytes (IEL) in the duodenum and a significantly greater number of IgA+plasma cells in the la mina propria (P ＜ 0.01). Conclusion: CGMP can enhance phagocytic activity, induce intestinal mucosal immune response and enhance the intestinal mucosal barrier function.

casein glycomacropeptide; intestinal mucosal barrier; phagocytic activity; intestinal intraepithelial lymphocytes; IgA+plasma cells

TS201.4

A

1002-6630（2014）09-0234-07

10.7506/spkx1002-6630-201409046

2013-12-18

国家自然科学基金面上项目（30771524；31071522）

叶雷（1989—），男，硕士研究生，研究方向为生物活性物质研究与肠道健康。E-mail：yelei20081020@126.com

*通信作者：陈庆森（1957—），男，教授，硕士，研究方向为食源性生物活性物质与肠道健康、蛋白质（酶）资源研究与开发。E-mail：chqsen@tjcu.edu.cn