干旱胁迫下长豇豆茎干持绿性的关联分析

鲁忠富,胡耀文,汪宝根,吴晓花,徐 沛,李国景

（浙江省农业科学院蔬菜研究所,浙江杭州 310021）

干旱胁迫下长豇豆茎干持绿性的关联分析

鲁忠富,胡耀文,汪宝根,吴晓花,徐 沛,李国景

（浙江省农业科学院蔬菜研究所,浙江杭州 310021）

利用已建立的快速、准确的长豇豆种质苗期耐旱性鉴定技术体系鉴定了我国99份长豇豆微核心种质的重要耐旱性指标茎干持绿性。利用覆盖全基因组的1127个SNP标记进行核心种质群体的基因型分析和表型-标记关联分析,获得与茎干持绿性显著相关的SNP标记4个（P＜10-4）。

长豇豆；耐旱；茎干持绿性；SNP；关联分析

豇豆［Vignaunguiculata（L.）Walp］起源于非洲,是重要的豆类作物。长豇豆（V. sesquipedalis）是豇豆的一个重要亚种,广泛种植于东南亚与中国各地。目前我国长豇豆年栽培面积在20万hm2以上,主要于夏秋季种植,以采摘嫩荚作为菜用。由于种植季节正值高温,干旱成为制约长豇豆生产的重要因素,严重影响长豇豆的产量和品质。挖掘、应用长豇豆耐旱基因是解决这一问题的重要手段［1］。

茎干持绿性（Stg）是指植物在遇干旱胁迫时能够在一定时期内保持其茎干叶绿素不被破坏,维持细胞正常生命功能的性状。该性状已被证明可作为豇豆、高粱、大麦等作物重要的耐旱性指标,并且具有测定简便、准确等优点［2］。关联分析是利用不同基因座等位变异（基因）间的连锁不平衡关系进行标记与性状的相关性分析的遗传学方法,以达到鉴定控制特定性状基因（或染色体区段）的目的［3］。连锁不平衡是指群体内不同基因座基因间的非随机性关联。关联分析已被广泛用于动植物重要性状基因的挖掘、鉴定工作［4］。本研究即利用基于SNP标记的关联分析开展豇豆耐旱性研究。

1 材料和方法

1.1 材料

以我国长豇豆微核心种质群体中的99份种质为研究材料。

1.2 处理设计

种质材料直播于盆钵中,在玻璃温室中栽培。基质为营养土和蛭石（1∶1）的混合物。实验设置正常对照组2个重复,干旱处理组3个重复。各盆钵中均用量器量取等量基质装填,播种时各播5粒种子,待第1对真叶平展后留取2株健壮一致的幼苗。胁迫处理前每盆钵每次均用等量且过量的水浇透基质。干旱处理组播种后18d停止浇水进行胁迫处理,在胁迫后第24d进行茎干持绿性表型观察。

1.3 测定项目及方法

1.3.1 基因型测定

DNA提取。取各材料叶片组织0.1g加液氮研磨成粉末,用Qiagene试剂盒参照说明书提取DNA。

基因型测定。用Kaspar豇豆DNA高通量SNP基因分型平台进行基因型分析,具体方法参考文献［5］。

1.3.2 茎干持绿性鉴定

将Stg分成0-5级：0级,茎干正常,无失绿；1级,≤20%茎干失绿；2级,20%～40%茎干失绿；3级,40%～60%茎干失绿；4级, 60%～80%茎干失绿；5级：＞80%茎干失绿至完全枯黄［6］。

1.4 关联分析

关联分析采利用Tassel2.1软件进行,在混合线性模型（MLM）下进行运算。所用群体的群体结构和亲缘关系系数采用文献［5］的数据。

2 结果与分析

对正常对照和干旱处理条件下豇豆微核心种质群体的Stg调查结果（图1）显示,对照组没有特征性的统计分布趋势,其Stg变异主要由品种的叶绿素含量高低造成。而干旱处理组则呈现偏向低值的近正态分布的特点,表明干旱胁迫处理对多数植株造成了较重的胁迫,并且群体的Stg分布规律明显,适宜进行关联作图分析。表1列出了对照和处理组豇豆微核心种质群体茎干持绿性描述统计值。

图1 正常对照和干旱处理下豇豆微核心种质群体的Stg值频率分布

表1 正常对照和干旱处理下豇豆微核心种质群体茎干持绿性描述结果

利用由高通量IlluminaGoldenGateSNP基因型检测平台转化而来的KsaparSNP基因型检测平台高通量检测了99份材料1127个SNP位点的基因型。结果表明,有1102个SNP成功检测到信号,技术成功率为97.7%。1102个SNP中,有8个SNP在群体中缺失信号超过20%,5个SNP在10%以上的材料中为杂合基因型,247个SNP在群体中无多态,420个SNP的次要等位位点频率值＜0.1。在去除上述低质量或低信息量SNP位点后,有422个SNP位点的基因型数据被用于连锁不平衡分析。SNPs在群体中呈双等位位点和连续频率分布,频率分布峰值在0.1～0.18。

采用Tassel软件的MLM关联分析表明,以Stg为指标能在处理组中检测到4个显著性位点（P= 10-4）,但在对照组不能检测到显著性位点。显著性位点及其P值见表2。

根据文献［7］,这4个标记中1-1162位点定位于LG3上,其他3个标记位点定位到了普通豇豆整合遗传图谱上［8］,其中1-1481和1-1021位点均定位于LG2上且紧密连锁,1-1286位点定位于LG10上。

表2 利用MLM关联分析获得的显著性位点（P＜10-4）

3 小结和讨论

本研究利用MLM方法检测到了4个与豇豆茎干持绿性关联的SNP位点,这些位点将作为潜在的分子标记位点用于今后的辅助育种。当前的工作正考虑利用传统QTL定位方法分析这些显著性位点与耐旱性相关QTL是否存在共定位关系。另外,由于SNP标记在实际育种中不如PCR标记简便,后续工作将考虑将SNP标记转化为PCR标记［9］。转化成功后利用转化的PCR标记只需通过检测豇豆材料的基因组内是否存在与控制茎干持绿性的耐热/旱基因显著关联的特异DNA片段,即可在苗期辅助快速确定该材料是否具对干旱胁迫的耐受性。

在普通豇豆耐旱性研究中,除茎干持绿性外,单叶和第1三出复叶衰老、植株萎蔫程度、三出复叶相对含水量、叶片最大光化学效率等指标也已被用于耐旱性研究。后续工作中将继续开展上述指标与长豇豆耐旱性的关系研究,以期获得更多与耐旱性关联更紧密的标记位点。

［1］ 汪宝根,刘永华,吴晓花,等.干旱胁迫下长豇豆叶绿素荧光参数与品种耐旱性的关系［J］.浙江农业学报, 2009,21（3）：246-249.

［2］ MucheroW,EhlersJD,RobertsPA.Restrictionsite polymorphism-basedcandidategenemappingforseedlingdrought toleranceincowpea［Vignaunguiculata（L.）.Walp.］［J］. TheorApplGenet,2010,120（3）：509-518.

［3］ ShuX,BackesG,RasmussenSK.Genome-wideassociationstudy ofresistantstarch（RS）phenotypesinabarleyvarietycollection［J］.JAgricFoodChem,2012,60（41）：10302-10311.

［4］ MucheroW,RobertsPA,DiopNN,etal.Geneticarchitectureof delayedsenescence,biomass,andgrainyieldunderdroughtstress incowpea［J］.PLoSOne,2013,8（7）：e70041.

［5］ XuP,WuX,WangB,etal.Genomewidelinkage disequilibriuminChineseasparagusbean（Vigna.unguiculata ssp.sesquipedialis）germplasm：implicationsfordomestication historyandgenomewideassociationstudies［J］.Heredity, 2012,109（1）：34-40.

［6］ MucheroW,EhlersJD,CloseTJ,etal.MappingQTLfor droughtstress-inducedprematuresenescenceandmaturityin cowpea［Vignaunguiculata（L.）Walp.］［J］.TheorAppl Genet,2009,118（5）：849-863.

［7］ XuP,WuX,WangB,etal.ASNPandSSRbasedgenetic mapofasparagusbean（Vigna.unguiculatassp.sesquipedialis）andcomparisonwiththebroaderspecies［J］.PLoSOne, 2011,6（1）：15952.

［8］ MucheroW,DiopNN,BhatPR,etal.Aconsensusgenetic mapofcowpea［Vignaunguiculata（L）Walp.］andsynteny basedonEST-derivedSNPs［J］.ProcNatlAcadSci,2009, 106（43）：18159-18164.

［9］ LiG,LiuY,EhlersJD,etal.IdentificationofanAFLP fragmentlinkedtorustresistanceinasparagusbeanandits conversiontoaSCARmarker［J］.HortScience,2007,42：1153-1156.

（责任编辑：张才德）

S643.4

A

0528-9017（2014）02-0202-02

文献著录格式：鲁忠富,胡耀文,汪宝根,等.干旱胁迫下长豇豆茎干持绿性的关联分析［J］.浙江农业科学,2014（2）：202-203,207

2013-12-18

国家自然科学基金项目（30900985）

鲁忠富（1963-）,男,浙江杭州人,实验师,从事蔬菜育种及新品种推广工作。E-mail：lzf0522@163.com。

李国景。E-mail：Guojing-li@yahoo.com.cn。