红茶添加对灵芝菌液态发酵产胞外多糖的影响

高佳佳，刘书来，丁玉庭

（浙江工业大学生物与环境学院，浙江杭州 310014）

红茶添加对灵芝菌液态发酵产胞外多糖的影响

高佳佳，刘书来，丁玉庭

（浙江工业大学生物与环境学院，浙江杭州 310014）

通过添加红茶对灵芝菌液态发酵产胞外多糖（EPS）影响的研究表明，培养基中添加红茶对灵芝菌液态发酵的菌体干重和EPS产量均有显著影响。当红茶添加量为2.5%时，对EPS产量的提高有显著的促进作用，为0.985 g∙L-1，比对照组增加80.2%；而菌体干重为7.818 g∙L-1时，比对照组下降43.6%。同时研究了在最适红茶添加量条件下，灵芝菌发酵菌体干重和胞外多糖EPS产量的变化过程，验证了其生物量与产物生成呈部分偶联型的代谢规律。

红茶添加；灵芝菌；菌体干重；胞外多糖（EPS）

灵芝菌（Ganoderma lucidum）是名贵的药食两用真菌，属真菌门担子菌亚门层菌纲非褶菌目灵芝菌科灵芝属［1］，在我国有2 000多年的食用历史，是滋补强壮、扶正固本之珍品，具有免疫调节、抗肿瘤［2］、清除机体自由基抗氧化［3］等多种功效。灵芝菌富含多种生理活性成分，主要为灵芝多糖和灵芝三萜等，其中灵芝多糖（EPS）的研究较为深入。由于传统的灵芝培养方式栽培期长且效率低下，故而随着深层液体发酵培养技术的发展，灵芝菌的开发利用即从固态的子实体转向了液体发酵的菌丝体。

我国是世界上产茶大国之一，茶制品的科技含量与附加值却较低。红茶在世界茶消费中占80%，其生物活性逐渐引起研究者的重视，因其营养成分丰富，存在茶多糖、维生素、微量元素等［4］特殊诱导因子，可促进灵芝菌EPS的合成，故而考虑利用红茶与灵芝菌进行混合发酵研究，不仅丰富了茶制品的营养与保健因子的种类与数量，还开辟了研发功能性保健品的新途径。此外，灵芝菌发酵过程中会代谢产生氨基酸和多酚氧化酶，降解红茶中的多酚类物质，提高氨基酸含量，从而改变红茶主要呈味物质的协调关系，改善其口感及品质。

1 材料与方法

1.1 供试材料与试剂

供试材料为普通红茶，购于杭州茶叶市场。供试菌种为鹿角灵芝（Ganoderma lucidum），由浙江工业大学食品系保存。试剂包括无水乙醇、苯酚、浓硫酸，均为分析纯。

1.2 培养基

参照文献［5］开展试验。

斜面种子培养基。为PDA琼脂培养基。

种子液培养基。每升加入葡萄糖20 g，甘油30 g，牛肉膏2.5 g，蛋白胨5.0 g，KH2PO41.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，维生素B10.05 g，碳酸钙1.0 g，初始pH值5.5。

发酵培养基。每升含葡萄糖30 g，甘油30 g，牛肉膏2.5 g，蛋白胨5.0 g，KH2PO41.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，维生素B10.05 g，碳酸钙1.0 g，红茶6.0 g，初始pH值5.5。

1.3 试验方法

1.3.1 菌种活化

斜面保藏菌种室温下放置5 h后，接入新配制的PDA琼脂培养基中，30℃活化5 d待用。

1.3.2 种子液培养

将活化后菌种切成5 mm×5 mm大小块状，取5块菌种接入100 m L新配制的种子液培养基（装于500 mL三角瓶）中，30℃，150 r·min-1条件下培养3 d待用。

1.3.3 发酵培养

取6%种子液接入50 m L新配制的发酵培养基（装于100 mL三角瓶）中，30℃，150 r·min-1条件下发酵培养9 d，每2 d取3瓶发酵液样品进行指标测定。

1.3.4 菌体干重测定

将样品恒重后用滤纸过滤，得到菌丝体滤渣，85℃恒重后称量记录数据。

1.3.5 EPS测定

苯酚硫酸法［5-6］。

1.3.6 菌体干重增加率与EPS增加率的计算

菌体干重增加率／%＝（试验组菌体干重-对照组菌体干重）／对照组菌体干重×100。

EPS增加率／%＝（试验组EPS产量-对照组菌体干重）／对照组菌体干重×100。

1.3.7 数据分析

采用SPSS17.0软件进行单因素方差分析和LSD多重比较，判断红茶添加对灵芝菌发酵菌体干重和EPS产量影响的显著性。

2 结果与分析

2.1 红茶添加量对灵芝菌发酵菌体干重和EPS产量的影响

考查红茶添加量分别为0.5%，1.0%，1.5%，2.0%，2.5%和3.0%的条件下，灵芝菌发酵7 d后，对菌体干重和EPS产量的影响如图1和2所示。

图1 红茶添加量对灵芝菌发酵菌体干重的影响

试验结果表明，不添加红茶的对照组发酵后最大菌体干重为13.853 g∙L-1，而添加红茶的各试验组其最大菌体干重均明显低于对照组，其中红茶添加量为2.5%和3.0%的试验组菌体干重分别比对照组下降了43.6%和42.4%，最大菌体干重分别为7.818和7.976 g∙L-1，均低于试验组（图1）。经方差分析和LSD多重比较分析可知，不添加红茶的对照组与添加红茶的试验组间菌体干重差异显著，即红茶的添加对灵芝菌发酵菌体干重的影响显著。而不同红茶添加量的试验组间，红茶添加量为2.5%，3.0%试验组的菌体干重分别与红茶添加量为0.5%的试验组差异显著，其他试验组间差异不显著。

如图2所示，红茶添加后试验组的最大EPS产量均有所提高，其中红茶添加量为2.5%的试验组EPS产量相较于各试验组最高，达到了0.985 g∙L-1，比对照组增加了80.2%。由此可知，红茶添加量为2.5%时，最有利于EPS产量的提高。经方差分析和LSD多重比较可知，不添加红茶的对照组与添加红茶的试验组间EPS产量差异显著，即红茶的添加对灵芝发酵EPS产量影响显著。而不同红茶添加量的试验组间差异显著性，红茶添加量为2.5%的试验组EPS产量与其他添加量的试验组之间差异显著，红茶添加量为0.5%的试验组与添加量分别为2.0%，2.5%，3.0%的试验组差异显著，添加量为1.0%的试验组与2.0%，2.5%，3.0%的试验组差异显著，添加量为2.0%的试验组与0.5%，1.0%，2.5%的试验组差异显著，添加量为3.0%的试验组与0.5%，1.0%，2.5%的试验组差异显著。

图2 红茶添加量对灵芝菌发酵EPS产量的影响

结合图1和2及数据分析可知，红茶添加量为2.5%对灵芝菌发酵菌体干重和EPS产量影响最为显著，故选择2.5%作为最适红茶添加浓度。根据菌体生情况，推断出红茶中含有抑菌物质，在灵芝菌发酵过程中，抑制了菌体干重的增长，同时却促进了EPS产量的提高。而从EPS的抗氧化、抗肿瘤和调节免疫等生理活性角度考虑，EPS产量的提高具有重要意义。

2.2 最适红茶添加量条件下菌体干重和EPS产量变化过程分析

在2.5%的最适红茶添加量条件下，考察了灵芝菌发酵过程中菌体干重和EPS产量的变化情况（图3）。红茶的添加抑制了灵芝菌菌体的生长，在0～3 d内，对照组的菌体生长经短暂的适应期后呈指数型增长；而试验组由于红茶中多酚类物质对灵芝菌生长的抑制作用使其适应期较长，生长较为缓慢。在3～5 d内，对照组的菌体生长速率减慢，开始进入稳定期；而试验组逐渐适应了茶叶中的多酚类物质，生长速率稍有增加。5 d后，对照组菌体开始自溶，菌体干重逐渐减少；而试验组菌体经过前期的适应，生长速率增加，在7～9 d内，经过稳定期开始自溶。

图3 添加2.5%红茶灵芝菌发酵过程中菌体干重变化

灵芝菌发酵过程中EPS产量变化见图4。红茶本身存在茶多糖，在灵芝菌未开始发酵前，培养环境中即存在少量多糖。在0～3 d内，试验组的多糖有先减少后增加趋势，而对照组EPS产量则快速增加。3～5 d内，对照组进入稳定期，EPS产量逐步积累至最大0.547 g∙L-1；试验组菌体开始适应红茶多酚类物质环境，且在各种有利于EPS生成的诱导因子促进下，EPS合成速率明显增加。5 d后，由于对照组菌体开始自溶，底物耗完，部分未自溶菌体利用已合成的胞外多糖满足自身生长，故EPS产量逐渐下降；而试验组灵芝菌的生长环境中底物未耗完，有利于EPS产量进一步增加，直至7 d达到最大产量0.985 g∙L-1。

图4 添加2.5%红茶后灵芝菌发酵过程中EPS产量变化

从图3和4得知，2.5%红茶中既存在抑制灵芝菌菌体生长的多酚类物质，又存在可以促进EPS合成和释放的各种诱导因子。此外，当灵芝菌菌体生长处于稳定期时，EPS的合成处于快速生长期，由此可见，灵芝菌的菌体生长和EPS合成属于部分偶联型的代谢［7］。

3 小结与讨论

红茶中富含多种蛋白质、氨基酸、生物碱、茶色素、茶多糖和维生素及矿物质，其营养丰富，有利于促进灵芝菌EPS的合成，同时红茶也含有具抑菌作用的多酚类物质。灵芝菌在发酵过程中会分泌一种能降解多酚类物质的多酚氧化酶，该酶可降解发酵液中的多酚，减少多酚类物质对灵芝菌菌体生长的影响，积累更多的胞外代谢产物［8］。因此，红茶添加到灵芝菌发酵过程中，培养基中含少量的多酚类物质，诱导灵芝菌合成多酚氧化酶，而多酚氧化酶的合成又可进一步降解多酚类物质，进而缓解多酚类物质对灵芝菌菌体生长的抑制，从而促使灵芝菌分泌胞外代谢产物EPS，达到提高EPS产量的目的。

由试验结果可以推测，2.5%红茶添加量中所含的多酚类物质浓度可能在灵芝菌发酵体系中处于一种最适平衡浓度，故而能最大限度地提高灵芝菌EPS产量。同时，由于红茶中丰富的营养成分可以进一步诱导灵芝菌合成EPS，因此添加2.5%红茶后，灵芝菌EPS产量比对照组提高81.2%。

在发酵开始的0～3 d适应期，灵芝菌未及时合成多酚氧化酶，灵芝菌菌体生长受到多酚类物质抑制，而红茶中本身存在的茶多糖被灵芝菌利用满足自身生长，EPS产量先减少后增加。3 d后，随着多酚氧化酶的合成，多酚类物质逐渐被降解，灵芝菌菌体逐渐适应生长环境开始进入快速合成EPS阶段直至7 d后稳定期结束菌体自溶，EPS产量下降。

综上所述，红茶的添加对灵芝菌液态发酵产EPS具有积极作用，而关于这方面的研究较少，具体机制也有待进一步研究。

［1］ 陈娜.灵芝菌液态发酵及其多糖抗氧化活性研究［D］.广州：华南理工大学，2012.

［2］ Zhao S F，Ye G，Fu G D，et al.Ganoderma lucidum exerts anti⁃tumor effects on ovarian cancer cells and enhances their sensitivity to cisplatin［J］.International Journal of Oncology，2011，38（5）：1319-1327.

［3］ Zhao W，Jiang X J，Deng W W，et al.Antioxidant activities of Ganoderma lucidum polysaccharides and their role on DNA damage inmice induced by cobalt-60 gamma⁃irradiation［J］. Food and Chemical Toxicology，2012，50（2）：303-309.

［4］ 徐永成.世界茶业经济及发展趋势［J］.中国茶叶，2002，24（4）：3-4.

［5］ 徐淑蓓，刘书来，丁玉庭.多菌种复合发酵对灵芝菌产胞外多糖的影响［J］.浙江工业大学学报，2012（4）：428-430，468.

［6］ Dubois M，Gilles K A，Hamilton J K，et al.Colorimetric method for determination of sugarsand related substances［J］. Analytical Chemistry，1956，28（3）：350-356.

［7］ 李平作，章克昌.灵芝胞外多糖分批发酵非结构动力学模型［J］.生物技术，1999，9（3）：24-26.

［8］ 殷亚峰，丁玉庭，欧阳喆，等.茶汁中灵芝菌产多酚氧化酶发酵条件的研究［J］.浙江工业大学学报，2005，33（4）：390-394.

（责任编辑：张瑞麟）

S 567 < class="emphasis_bold">文献标志码：B

B

0528⁃9017（2014）01⁃0082⁃03

文献著录格式：高佳佳，刘书来，丁玉庭.红茶添加对灵芝菌液态发酵产胞外多糖的影响［J］.浙江农业科学，2014（1）：82-85.

2013⁃10⁃04

高佳佳（1987-），女，浙江杭州人，硕士研究生，从事食品生物技术方面研究工作。E⁃mail：gaojiajia1123＠163.com。

刘书来（1977-），男，山东菏泽人，博士，副教授，研究方向为食品生物技术。E⁃mail：slliu＠zjut.edu.cn。