rBTI的制备及其对果蝇寿命的影响

李 娇，崔晓东，李玉英，冯思思，王转花*

（化学生物学与分子工程教育部重点实验室，山西大学生物技术研究所，山西 太原 030006）

rBTI的制备及其对果蝇寿命的影响

李 娇，崔晓东，李玉英，冯思思，王转花*

（化学生物学与分子工程教育部重点实验室，山西大学生物技术研究所，山西 太原 030006）

构建含荞麦胰蛋白酶抑制剂（rBTI）表达质粒pExSecI-BTI的工程菌，在100 L发酵罐中放大发酵，发酵产物经热处理及离子交换层析纯化后，获得rBTI产品，其纯度达到95%以上。用含不同质量浓度rBTI（0、20、50 μg/mL）的培养基饲养果蝇，并分别检测果蝇的最高寿命，平均寿命和半数死亡时间等。初步研究rBTI对果蝇寿命的影响。结果显示，rBTI能够显著延长果蝇的寿命。在实验剂量范围内，果蝇的寿命与rBTI质量浓度呈现正相关。抗氧化酶活性检测发现，实验组果蝇体内的SOD和CAT活性均显著升高。rBTI延缓果蝇衰老的作用可能是通过刺激机体的氧化应激能力来实现的。

荞麦胰蛋白酶抑制剂；果蝇；寿命；抗氧化作用

荞麦是蓼科荞麦属（Fagopyrum）作物，在世界各地广泛种植，主要有甜荞麦（common buckwheat）和苦荞麦（tartary buckwheat）两个栽培种[1]。近年来，医学及营养学等研究表明，荞麦特别是苦荞麦，不仅营养成分丰富、营养价值高，而且还含有其他粮食作物所缺乏或不具有的特种微量元素及药用成分，这些物质对现代“文明病”及几乎所有中老年心脑血管疾病有很好的预防和治疗功能[2]。此外，荞麦蛋白质的生理功能也逐渐引起许多学者的关注，如阻止7,12-二甲苯蒽诱发的乳腺癌[3]、抑制1,2-二甲阱诱发的大肠癌[4]、抑制人乳腺癌细胞株Bcap37细胞增殖[5]等。因此，荞麦也被认为是预防癌症的保健食品，受到各国科学家的重视。荞麦胰蛋白酶抑制剂（buckwheat trypsin inhibitor，BTI）是由69个氨基酸组成，分子质量为7.9 kD的小分子蛋白，属于Potato I型抑制剂家族，该抑制剂对胰蛋白酶有特异性抑制作用[6]，并且对多种肿瘤细胞表现出显著的增殖抑制作用[7-8]和诱导细胞自噬的功能[9]，目前已成为医药及食品科学领域的研究热点。

近期研究报道，雷帕霉素诱导的细胞自噬在早期有助于延缓果蝇衰老[10]，一些植物源生物活性物质如槲皮素、白藜芦醇等也被报道能够延长线虫的寿命[11-12]，但有关BTI在抗衰老方面的研究还未见报道。为了揭示BTI对机体衰老的影响，本实验通过基因工程的方法，构建了包含蛋白酶抑制剂BTI基因的工程菌，通过实验室放大发酵、纯化等制备重组荞麦胰蛋白酶抑制剂（recombinant buckwheat trypsin inhibitor，rBTI），并研究了其对果蝇寿命的影响，探讨其可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

工程菌E.coli BL21（DE3）- pExSec I-BTI由本实验室构建保存；野生型黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）由山西大学分子与遗传实验室提供；SOD和CAT试剂盒由南京建成生物工程研究所研制；其余试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

Lx800酶标仪 美国宝特Bio-Tek公司；S-450D超声波细胞破碎仪 美国Branson公司；ÄKTA Explorer 蛋白分析纯化系统 美国General Electric公司；GUJS-100 -发酵罐（100 L） 中国浙江东方生物技术公司。

1.3 方法

1.3.1 rBTI的发酵制备

1.3.1.1 基因工程菌的发酵

从超低温冰箱中取出保存的E.coli BL21（DE3）-pExSec I-BTI工程菌，待融化后取出10 μL，加入90 μL LB培养基，混匀，在LB平板（含25 μg/mL Kan）划线，37℃恒温培养12 h，挑取单菌落于5mL含30 μg/mL Kan的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜，至OD600nm为0.8，作为一级种子。将其按1%接种量转接到500 mL（Kan质量浓度为25 μg/mL）液体LB培养基中，37℃、180 r/min振荡培养6 h，培养至OD600nm为2左右，作为二级种子备用。采用100 L发酵罐，按0.7的装料系数加入培养基，实罐121℃，高压灭菌20 min（葡萄糖和磷酸盐分开单独灭菌）。待培养基温度降为室温，控制自动发酵罐温度在37℃，将培养基的pH值用NH3•H2O调至7.3。加入二级种子，并根据溶氧值不断调整通气流量和搅拌转速，控制溶氧10%以上。最大转速500 r/min。每1 h测OD600nm、培养基残糖、残氮含量，以利于下一步诱导。当OD600nm达到10左右（对数中后期），阶段式流加补料培养基，控制残糖含量不低于4～5 g，残氮含量不低1～2 g。1 h后加入诱导剂IPTG，从加入诱导剂后每隔1 h取样电泳检测。加入IPTG诱导剂4 h后，结束发酵。培养基中还原糖及NH4+含量测定参照文献[13-14]进行。发酵菌体破碎后，分别在60～90℃条件下进行热处理，12 000 r/min离心，分离上清液和沉淀，沉淀用8 mol/L尿素溶解后，分别进行电泳分析。

1.3.1.2 rBTI的纯化

发酵结束后，离心收集菌体，超声液将菌体重悬，再次离心，洗去菌体表面残留的培养基，收集菌体进行称重。将菌体用超声液重悬后，冰浴条件下, 超声波破碎菌体，直至菌体悬浮液由黏稠变为透亮。破碎的菌液，经过60～90℃处理20 min，12 000 r/min离心，分离上清和沉淀，分别进行电泳分析，确定最佳热处理条件。将菌液在确定最佳热处理对应温度的水浴中热处理20 min，12 000 r/min离心10 min，除去沉淀。将上步收集的上清，上样于Resource™ Q在ÄKTATMExplore进行初步分离。平衡缓冲液为20 mmol/L，pH 7.5的Tris-HCl缓冲液，洗脱液为20 mmol/L Tris-HCl（内含0.5 mol/L NaCl）缓冲液。将收集的洗脱液用脱盐柱除去多余的NaCl，收集的样品进行SDS-PAGE分析。

1.3.2 rBTI的抗衰老研究

1.3.2.1 rBTI对果蝇寿命的影响

收集4 h内新羽化的成虫，乙醚麻醉，取雌、雄果蝇各320只，随机分为对照组和两个剂量用药组，每组雌雄各60只。对照组普通培养基饲养，实验组分别用含终质量浓度为20 g/mL和50 g/mL rBTI的培养基饲养。在25℃、相对湿度50%的恒温培养箱中培养，饲喂过程中，每3 d更换新鲜培养基，在用药20 d后每天对各组死亡果蝇进行统计，直至全部死亡，计算果蝇半数死亡时间、最高寿命及平均寿命[15-16]。

1.3.2.2 rBTI对果蝇SOD和CAT活性的影响

按照1.3.2.1节果蝇培养的方法，在给药rBTI 20 d后将果蝇进行麻醉致死，称质量。生理盐水洗去残留培养基，用吸水纸吸干。按1∶10（m/V）加磷酸缓冲（PBS）溶液。用玻璃匀浆器在冰浴条件下将果蝇进行匀浆，将匀浆液4℃、2 500 r/min离心20 min，取上清，按SOD和CAT检测试剂盒说明检测酶活性。

1.4 数据分析

2 结果与分析

2.1 rBTI的发酵制备

由图1可知，加热处理可除去大部分变性的杂蛋白（泳道4、6、8、10）。当处理温度为80℃时，rBTI大部分以可溶的方式存在于上清液中，占总含量的90%以上（泳道7）。80℃处理（泳道7）和90℃处理（泳道9）效果相当，因此，选择80℃热处理20 min，作为rBTI纯化前的预处理。

将经80℃加热处理，离心得到的上清液，用阴离子交换层析和凝胶过滤进一步分离纯化后，收集的样品经Tricine-SDS-PAGE进行纯度检测。结果显示，通过两步层析分离获得的rBTI的纯度达到95%以上，电泳结果显示单一条带，无二聚体等出现，与预期结果一致（图2）。

图2 rBTI的分离纯化及电泳检测Fig.2 Analysis of rBTI by size exclusion chromatography and Tricine-SDS-PAGE

2.2 果蝇寿命的检测

由图3可知，rBTI能够显著延长果蝇的寿命，并且呈现一定的质量浓度依赖性。当rBTI的质量浓度为20 μg/mL时，雌性果蝇寿命延长了19.28%，雄性果蝇寿命延长了28.50%；当rBTI质量浓度为50 μg/mL时，雌性果蝇寿命延长了30.50%，雄性果蝇寿命延长了35.00%。此外，雌性和雄性果蝇的半数死亡时间和最高寿命都有明显延长（表 1）。表明rBTI具有延缓果蝇衰老的作用。同时也发现，对照组和样品组，雌性果蝇的平均寿命及最高寿命均高于雄性果蝇，但饲用rBTI后雄性果蝇的寿命延长幅度要高于雌性果蝇（表1），推测rBTI对雄性果蝇的抗衰老作用可能更为明显。

图3 rBTI对果蝇寿命的影响Fig.3 Effect of rBTI on the lifespan of fruit flies

表1 rBTI对果蝇寿命的影响Table 1 Effect of rBTI on the lifespan of fruit flies(x ±s

表1 rBTI对果蝇寿命的影响Table 1 Effect of rBTI on the lifespan of fruit flies(x ±s

组别半数死亡时间/d平均寿命/d最高寿命/d雌雄雌雄雌雄空白对照454047.20±5.3340.30±3.655547 20 μg/mL rBTI545056.30±4.0351.80±3.856258 50 μg/mL rBTI605561.60±3.7256.90±3.576763

2.3 rBTI对果蝇SOD和CAT活性的影响

图4 rBTI 对果蝇体内SOD和CAT活性的影响Fig.4 Effect of rBTI on SOD and CAT activities in fruit flies

用含有rBTI（20、50 μg/mL）的培养基培养果蝇20 d后，检测其SOD和CAT的活性。结果表明，与对照组相比，果蝇体内的SOD和CAT的活性均有所提高，且呈现明显的剂量依赖效应（图4）。当rBTI的质量浓度为50 μg/mL时，对果蝇体内SOD和CAT活性影响最为明显，雌性果蝇体内SOD的活性比对照组升高了27.7%（分别为99.98、78.31 U/g pro），CAT活性升高了30.9%（分别为749.54、572.80 U/mg pro）；而雄性果蝇体内SOD活性升高了33.2%（分别为90.33、67.8 U/g pro），CAT活性升高35.3%（分别为651.10、481.21 U/mg pro）。这些结果表明，rBTI对果蝇体内的两种主要抗氧化酶活性有一定的影响，可提高其抗氧化防御系统清除自由基的能力。该结果与前述果蝇寿命检测实验的结果相一致。rBTI用药后雄性果蝇体内SOD和CAT活性提高的幅度要大于雌性果蝇，这可能是雄性果蝇寿命的延长幅度大于雌性的原因。

3 讨 论

荞麦作为一种药食同源的小杂粮作物，含有诸多生物活性物质，在食品和医药学领域受到普遍关注。目前，已有多种含有荞麦活性成分的功能性食品面世，为改善心脑血管疾病患者的饮食及健康状况提供了保障。另外，其中的活性多肽和功能蛋白的作用也引起人们的关注[17]。本实验采用pExSecI-BTI表达载体，通过优化发酵及纯化条件，经原核表达、发酵、纯化制备获得了纯度大于95%的功能蛋白rBTI。经计算，本研究中，在100 L发酵液中，可获得15.4 g的高纯度rBTI，且实验中利用rBTI耐热的性质，对发酵获得的粗品先进行加热处理，除去大部分杂蛋白，减少了纯化步骤，提高了纯化效率，获得的产品在Tricine-SDS-PAGE中显示单一条带，该加热处理对一些耐热的蛋白质及多肽的提取同样有效。本实验建立的方法不仅为研究rBTI的生物学功能提供了基础，也为其他相关蛋白的大规模制备和纯化提供了借鉴的方法。此外，本研究选用的表达载体pExSecI，其基因型是Kanr、MCS、T7启动子、M13复制区，含有BamH I、Nde I酶切位点，无任何标签序列，在E.coliBL21（DE3）中能稳定表达，表达产物以可溶形式存在，纯化后得到的rBTI纯度高，为rBTI及相关基因工程产品的规模化制备提供了方法和依据。

通常，机体衰老与体内大量积累O2－·、H2O2、·OH等自由基有关，这些自由基可破坏脂质、蛋白质和核酸分子的结构，使细胞成分积累性氧化损伤[18]。除此自由基衰老理论外，另一普遍被接受的理论是生活速率衰老理论，该理论强调，决定有机体寿命的是在细胞水平产生和利用能量的效率，能量利用效率的提高能够减缓机体衰老[19]。本实验为评价rBTI的抗衰老功效，选取模式生物果蝇作为对象，这是因为果蝇具有与人类相似的抗衰老途径，能够快速评价抗衰老作用并研究作用机制。实验结果表明，rBTI能够延缓果蝇的衰老，同时可提高果蝇体内的抗氧化酶SOD、CAT的活性，而SOD和CAT是机体抗氧化防御系统的主要成分[20]，由此推断，rBTI延缓果蝇衰老的作用可能依赖于自由基衰老理论，即rBTI提高了果蝇体内的抗氧化物酶活性，增强了果蝇机体的抗氧化防御能力，提高了对自由基的清除能力，从而起到了延缓衰老的效果。有关rBTI在抗衰老、改善机体的抗氧化防御系统，清除自由基等方面的内容有待进一步深入研究。

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Preparation of Recombinant Buckwheat Trypsin Inhibitor and Its Effect on the Lifespan of Drosophila melanogaster

LI Jiao, CUI Xiao-dong, LI Yu-ying, FENG Si-si, WANG Zhuan-hua*
(Key Laboratory of Chemical Biology and Molecular Engineering, Ministry of Education, Institute of Biotechnology, Shanxi University, Taiyuan 030006, China)

E. coli BL21(DE3) containing recombinant plasmid pExSecI buckwheat trypsin inhibitor (BTI) was constructed by gene cloning, and was cultured in a 100 L fermentor for large-scale fermentation. The fermentation products were purified by heat treatment and ion exchange chromatography. The purity of recombinant BTI obtained was greater than 95% after a series of optimization steps. Then fruit flies were fed with a medium containing different concentrations of rBTI (0, 20, 50 μg/mL). The maximum lifespan, average lifespan and lethal dose-50 time were tested, respectively. The effect of the purified rBTI on he fruit fly’s lifespan was studied. The results showed that rBTI significantly extended the lifespan of fruit fly in a dose-dependent way within the range of experimental doses. At the same time, the activities of superoxide dismutase (SOD) and catalase (CAT) were found to be significantly increased in the fruit flies of the experimental group. The preliminary studies indicate that the anti-aging effect of rBTI on fruit flies may be achieved by increasing its anti-oxidative stress ability.

buckwheat trypsin inhibitor; Drosophila melanogaster; lifespan; antioxidation

Q599

A

1002-6630（2014）07-0202-04

10.7506/spkx1002-6630-201407040

2013-10-14

国家自然科学基金面上项目（31171659）；国家自然科学基金青年科学基金项目（31300653）；太原市科技攻关计划项目（100622）

李娇（1989—），女，硕士研究生，研究方向为蛋白质化学与工程。E-mail：976443538@qq.com

*通信作者：王转花（1956—），女，教授，博士，研究方向为蛋白质工程与生物活性物质。E-mail：zhwang@sxu.edu.cn