乳源酪蛋白糖巨肽对小鼠外周血T淋巴细胞亚群的影响

叶 雷，陈庆森*，李 伟，阎亚丽，赵 培，庞广昌，胡志和

（天津市食品生物技术重点实验室，天津商业大学生物技术与食品科学学院，天津 300134）

乳源酪蛋白糖巨肽对小鼠外周血T淋巴细胞亚群的影响

叶 雷，陈庆森*，李 伟，阎亚丽，赵 培，庞广昌，胡志和

（天津市食品生物技术重点实验室，天津商业大学生物技术与食品科学学院，天津 300134）

目的：酪蛋白糖巨肽（caseino-glycomacropeptide，CGMP）是κ-酪蛋白经凝乳酶和胃蛋白酶酶解后形成的含有64个氨基酸的不同种类肽段，具有多种生物学活性和独特的营养特性，探讨CGMP对小鼠外周血 T淋巴细胞亚群的影响。方法：以健康小鼠为实验动物，利用流式细胞仪分别检测 长期和短期灌胃不同剂量的CGMP（30、60、120μg/d）后，小鼠外周血 淋巴细胞亚群的变化。结果：乳源CGMP干预后的结果表明，在短期灌胃实验中，灌胃不同剂量后CD3+淋巴细胞数比例均显著降低，12h后恢复灌胃前水平；C D3+CD4+和CD3+CD8+淋巴细胞比例在灌胃30μg和120μg CGMP 4h后均显著降低，而60μg组则无明显变化；长期灌胃实验中，在第2天和第4天，外周血中CD3+淋巴细胞和CD3+CD4+比例与对照组相比显著升高（P＜0.05）；120μg/d剂量组的小鼠外周血中CD3+CD8+淋巴细胞比例与对照组相比显著升高（P＜0.05），而30μg/d 剂量组在2、4、6、8d与对照组相比无显著变化（P＞0.05）；在第2天，30μg/d和120μg/d剂量组外周血中CD3+CD4+/ CD3+CD8+比例与对照组 相比显著升高（P＜0.05）。结论：乳源CGMP能够引起正常小鼠的外周血淋巴细胞亚群发生变化，调节机体T淋巴细胞亚群的平衡，由此提示CGMP可作为功能性食品对外周血T淋巴细胞亚群的失衡有缓解作用。

酪蛋白糖巨肽；淋巴细胞亚群；CD4+细胞；CD8+细胞；功能性食品

生物活性肽（biological active peptides，BAP）是指能够调节生物机体生命活动或具有某些生理活性作用的，一类20种天然氨基酸以不同的组成和排列方式构成的从二肽到复杂的线性、环形结构的不同多肽的总称。它们是涉及生物体内多种细胞功 能的生物活性物质，是机体完成分子识别、信号传导、细胞分化、免疫功能及个体发育等多种复杂的生理活动必不可少的参与者[1]。牛乳中含有丰富的蛋白质，包括酪蛋白、乳清蛋白、乳白蛋白、乳球蛋白、乳铁蛋白和一些具有重要生理功能的酶类，其中酪蛋白约占80%，是牛乳蛋白的主体。目前，来源于酪蛋白的生物活性肽主要有：酪啡肽（c asomorphins）、酪激肽（casokinins）、酪新素（casoxins）和来自于κ-酪蛋白的酶解产物酪蛋白糖巨肽（CGMP）等[2]。乳源CGMP是1965年Delfour等[3]发现κ-酪蛋白的特定位点经凝乳酶切断，生成可溶于三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）的部分多肽产物，因该多肽含有较多的糖链，于是被称为糖巨肽（glycomacropeptide，GMP），而酪蛋白来源的此类肽都统称为酪蛋白糖巨肽（caseino-glycomacropeptide，CGMP）。CGMP是乳清中重要的一种活性多肽，由64个氨基酸残基组成，含有较多的BCAA（是指亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸的总和）序列，而缺少芳香族氨基酸，包括苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸。通过对CGMP的结构分析，发现糖链主要有以O-糖苷型结合的2种中性糖链和3种酸性糖链，90%以上的结合糖链都含唾液酸[4]。构效鉴定结果显示，如果将CGMP中的唾液酸消化掉，则许多生物学活性就会减弱或消失。到目前为止，含有乳源CGMP的功能性食品或添加剂已经应用到人们的生活中，日本雪印乳业株式会社开发了一种含CGMP乳制品[5]，用来促进人体B淋巴细胞的增殖；近期的研究发现CGMP可用于炎症性肠病（inflammatory bowel disease，IBD）患者的保健营养食品，来改善肠内微生态平衡或调节免疫功能，从而达到治疗效果[6-11]。

大量的研究报道已经表明，生物活性肽的免疫调节作用主要有两种方式：一种是免疫刺激活性，另一种就是调节微生态活性[12-15]。通过体内实验已经发现，CGMP确实能够调节肠道微生态区系，促进益生菌的生长，抑制有害菌，使肠道的菌群的数量和分布更加合理。T淋巴细胞主要包括CD4＋和CD8＋细胞亚群，CD3是成熟T淋巴细胞的标志，CD4＋代表T辅助细胞，是免疫反应的中心细胞，根据分泌细胞因子的不同，又可以分为Th1、Th2和调节性T细胞，当激活后，通过分泌不同的细胞因子来调节机体的细胞免疫和体液免疫；而CD8＋淋巴细胞代表T抑制性细胞和T杀伤性细胞，是免疫反应的效应细胞。目前研究已经发现，CD4＋和CD8＋细胞在功能上相互协作，相互制约，维持着正常的动态平衡，调节机体正常的免疫功能。一旦这个平衡被打破，就会导致机体的免疫功能紊乱而致病。例如：腹泻型肠易激综合症（D-IBS）就会引起外周血中T淋巴细胞亚群的失衡，CD4+细胞和CD4+/CD8+比值显著降低，引起免疫调节异常[16]。

目前，调节人体免疫功能的食品研发是食品行业的热点之一。人们关注的焦点已经转向营养免疫学领域[17]，特别是营养物质是否既具有营养价值，也具有免疫调节功能[6,18-19]。事实证明，生物体内和体外研究的作用机理并不相同，在体内由于有各种消化酶和肠道微生物群系的存在，使得CGMP体内免疫作用变得更为复杂，甚至可能得出与体外作用相反的结果。本实验通过CGMP对外周血淋巴细胞亚群的影响作用，为寻找并力求开发治疗机体免疫功能紊乱方面功能性食品提供科学的理论依据。综上所述，寻找并研究一些食源性生物活性物质，对于促进机体内淋巴细胞亚群的平衡，维持机体正常的免疫功能以及新药的创制具有重要价值[20-22]。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

7周龄昆明雌性小鼠120只，SPF级，平均体质量为（25.53±1.65）g，购自中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心。

乳源CGMP 新西兰Tatua公司；CD3-FITC、CD4-Percp、CD8α-PE 美国Becton Dickinson公司。

1.2 仪器与设备

FACSCalibur流式细胞仪 美国Becton Dickinson公司；PHS-3B pH计 上海雷磁仪器厂；3K15高速冷冻离心机 德国Sigma公司；FA2004A电子分析天平 上海精天有限公司。

1.3 方法

1.3.1 动物分组

短期灌胃CGMP的实验，将24 只昆明小鼠随机分为3 个剂量组，每组8 只，分别为30 μg组、60 μg组、120 μg组，实验期间小鼠自由进食和饮水。

连续灌胃CGMP的实验，将小鼠随机分为3 组，每组32 只，分别为0.9%生理盐水对照组，30 μg/d剂量组和120 μg/d剂量组，期间各组小鼠自由进食和饮水。

1.3.2 样本采集

短期灌胃CGMP的研究中分别在未灌胃以及灌胃后4、8、12、24 h眼眶取血；连续灌胃CGMP的研究中分别在灌胃后2、4、6、8 d眼眶取血；将血液放入含有肝素的1 mL离心管内，混匀，4 ℃保存。

1.3.3 三色荧光标记

CD3-FITC、CD4-Percp单抗试剂按1∶9的比例用PBS缓冲液进行稀释，CD8α-PE稀释比为1∶4；10×溶血素与蒸馏水按照1∶9的比例进行稀释。吸取100 μL的抗凝血加入流式管中，分别加入稀释后的CD3-FITC、CD4-Percp、CD8α-PE单抗各5 μL；另取4 管血样，按照相同剂量加入同型抗体和单抗组合，作为阴性对照和用于调节流式细胞仪荧光电压。涡旋混匀，避光室温孵育30 min。加入稀释后的溶血素2 mL，涡旋混匀，避光孵育10 min。1 200 r/min离心5 min，弃上清，用2 mL PBS缓冲液洗涤一次，加入含1%多聚甲醛的PBS溶液0.5 mL混匀，放于4 ℃冰箱中待测。

1.3.4 流式细胞仪分析

淋巴细胞亚群用流式细胞仪进行分析，首先通过调整荧光电压，使阴性群体位于散点图的左下角。根据前向光（forward scatter，FSC）和侧向光（side scatter，SSC）圈定淋巴细胞群体。其中CD3＋细胞、CD4＋细胞和CD8+细胞分别用FL1、FL2和FL3通道进行获取，每管获取104个细胞。结果用CD3＋细胞、CD3＋CD4＋双阳性细胞和CD3＋CD8＋双阳性细胞分别占门内淋巴细胞的百分比表示。利用BD CellQuest Pro数据分析软件对十字门内细胞的比例进行统计。

1.4 数据分析

用SPSS16对数据进行单因素方差分析和配对t检验分析；P＜0.05表示差异显著，P＜0.01差异极显著；数值利用±s表示。

2 结果与分析

2.1 小鼠外周血T淋巴细胞亚群分群情况的流式细胞术分析

由图1可知，不同剂量CGMP灌胃后CD3+CD8+双阳性淋巴细胞亚群和CD3+CD4+双阳性淋巴细胞亚群均可明显地分群。

图1 CGMP对小鼠外周血淋巴细胞亚群影响的流式细胞分析点图Fig.1 Dot plots representing effects of CGMP on the peripheral blood lymphocytes

2.2 短期灌胃CGMP后外周血T淋巴细胞亚群的变化

2.2.1 短期灌胃不同剂量的CGMP后外周血CD3+淋巴细胞亚群的变化

图2 不同剂量的CGMP灌胃后外周血CD3+淋巴细胞的变化Fig.2 Effect of different dosages of CGMP on CD3+ cells in peripheral blood after oral administration

由图2可知，30 μg组在灌胃4 h后，CD3+淋巴细胞数比例显著降低（P＜0.01），8 h后降至最低水平，12、24h CD3+淋巴细胞数比例有所回升但与灌胃前相比差异仍极显著；60μg组在灌胃4 h后，CD3+淋巴细胞显著减少（P＜0.05），8、12、24 h与灌胃前相比并无显著差异；而120 μg/d组在灌胃4、8 h后CD3+淋巴细胞数量与对照组相比显著减少（P＜0.01），12 h恢复至灌胃前水平，24 h后与灌胃前相比显著减少（P＜0.01）。

2.2.2 短期灌胃不同剂量的CGMP后外 周血CD3+CD4+淋巴细胞的变化

图3 不同剂量的CGMP灌胃后外周血CD3+CD4+淋巴细胞的变化Fig.3 Effect of different dosages of CGMP on CD3+CD4+ cells in peripheral blood after oral administration

由图3可知，30 μg组在灌胃4 h后CD3＋CD4＋淋巴细胞开始显著下降，8 h降至最低，12 h后回升至与灌胃前无显著差异的水平，24 h后又显著降低（P＜0.01）；60 μg组在灌胃后4、8、12、24 h CD3＋CD4＋淋巴细胞数量与灌胃前相比均没有显著变化；120 μg组在灌胃后4 h，CD3＋CD4＋淋巴细胞显著降低（P＜0.01），12 h后回升至与灌胃前无显著差异，24 h后降至最低值。

2.2.3 短期灌胃不同剂量的CGMP后外周血CD3＋CD8＋淋巴细胞的变化

图4 不同剂量的CGMP灌胃前后24h外周血CD3+CD8+淋巴细胞的变化Fig.4 Effect of different dosages of CGMP on CD3+CD8+ cells in peripheral blood after oral administration

由图4可知，30 μg组在灌胃4 h后，CD3+CD8+细胞比例显著降低（P＜0.05），8 h后降至最小值，12 h后回升，与灌胃前水平差异不显著（P＞0.05）；60 μg组在灌胃前后并无显著差异（P＞0.05）；120 μg组在灌胃后4h外周血CD3＋CD8＋淋巴细胞数比例显著下降（P＜0.01），随后细胞数比例维持不变。

2.2.4 短期灌胃不同剂量的CGMP对CD3＋CD4＋/ CD3+CD8+比值的影响

图5 不同剂量的CGMP灌胃前后24h外周血CD3+CD4+/CD3+CD8+的变化Fig.5 Effect of different dosages of CGMP on CD3+CD4+ /CD3+CD8+ in peripheral blood after oral administration

由图5可知，所有剂量组在灌胃后4 h和8 h，与灌胃前相比CD3＋CD4＋/CD3＋CD8＋比值降低，但并无显著性差异（P＞0.05），12 h后比值有所升高（P＞0.05），24h后又恢复到灌胃前水平。

2.3 连续灌胃CGMP后外周血T淋巴细胞亚群的变化

2.3.1 连续灌胃不同剂量CGMP后外周血CD3＋淋巴细胞亚群的变化

图6 不同剂量组的CGMP对小鼠外周血CD3+淋巴细胞的影响Fig.6 Effects of different dosages of CGMP on peripheral blood CD3+ lymphocytes in mice

由图6可知，在灌胃第2天和第6天，120μg/d组小鼠外周血中CD3+淋巴细胞比例与对照组相比显著升高（P＜0.05）；30μg/d组在连续灌胃后CD3+淋巴细胞比例均无显著变化（P＞0.05）。

2.3.2 连续灌胃不同剂量CGMP后外周血CD3+CD4+淋巴细胞的变化

由图7可知，在第2天和第6天，120μg/d组的外周血中CD3+CD4+淋巴细胞比例与对照组相比显著升高（P＜0.05）；30μg/d组在连续灌胃阶段与对照组相比均无显著变化（P＞0.05）。

图7 不同剂量组的CGMP对小鼠外周血CD3+CD4+淋巴细胞的影响Fig.7 Effects of different dosages of CGMP on peripheral blood CD3+CD4+ lymphocytes in mice

2.3.3 连续灌胃不同剂量CGMP后外周血CD3+CD8+淋巴细胞的变化

图8 不同剂量组的CGMP对小鼠外周血CD3+CD8+淋巴细胞的影响Fig.8 Effects of different dosages of CGMP on peripheral blood CD3+CD8+ lymphocytes in mice

由图8可知，在灌胃第6天，120μg/d组外周血中CD3+CD8+淋巴细胞比例与对照组相比显著升高（P＜0.05）；而30μg/d组在连续灌胃阶段与对照组相比均无显著变化（P＞0.05）。

2.3.4 连续灌胃不同剂量CGMP对CD3＋CD4＋/CD3＋

CD8＋比值的影响

图9 不同剂量组的CGMP对小鼠外周血CD3+CD4+/CD3+CD8+比值的影响Fig.9 Effects of different dosages of CGMP on peripheral blood CD3+CD4+/CD3+CD8+ ratio in mice

由图9可知，在灌胃第2天，30μg/d组和120μg/d组的小鼠外周血CD3＋CD4＋/CD3＋CD8＋比值与对照组相比均显著升高（P＜0.05），随后两个剂量组小鼠外周血CD3＋CD4＋/CD3＋CD8＋比值与对照组相比均无显著变化（P＞0.05）。

3 讨 论

T淋巴细胞在机体细胞免疫和体液免疫中起着极为重要的作用，具有免疫防御、免疫调节、免疫监视等作用。研究资料表明，Th/Tc细胞的平衡在自身免疫性疾病的发生、发展过程中起重要作用[17,20]。CD4是T辅助/诱导细胞（Th/Ti）的表面标志，CD4＋T细胞具有辅助T细胞转变成效应细胞、B细胞转化成浆细胞以及活化巨噬细胞等功能，起辅助、诱导细胞及体液免疫的作用。CD8＋是T抑制/杀伤细胞（Ts/Tc）的表面标志，CD8＋T细胞具有细胞毒效应，它能抑制T细胞活化、抑制B细胞产生抗体，起抑制细胞及体液免疫的作用。Th细胞是机体免疫应答的中心细胞，CD4＋/CD8＋T（Th/Tc）比例变化反应机体的免疫功能状况，比例升高表明免疫功能亢进，比例降低表明免疫功能低下。T淋巴细胞亚群之间相互调节，在正常的生理状态，CD3＋CD4＋/CD3＋CD8＋值相对稳定，维持机体的正常免疫功能。医学上T淋巴细胞亚群的测定是检测机体细胞免疫功能的重要指标。目前，已经发现登革热病毒感染者、冠心病患者、乙肝患者、胃癌患者等的外周血T淋巴细胞亚群都会发生异常。几种血液病患者的T淋巴细胞亚群的测定结果表明，原发性粒细胞减少症患者的T细胞亚群分布具有明显的不均一性，主要为CD4＋细胞比例减少，CD8＋细胞比例增多[6]。

本实验中，当灌胃不同剂 量的CGMP后，通过在一天内不同的时间点来检测T淋巴细胞亚群的变化趋势，尽管60μg的剂量不能够引起CD4＋，CD8＋淋巴细胞的显著变化，但低、高剂量CGMP4h后都能引起CD4＋、CD8＋淋巴细胞比例的显著降低，12h后回升至灌胃前水平，与灌胃前相比差异不显著（P＞0.05）；灌胃后一天内不同阶段CD4＋/CD8＋比值有所波动，但是与灌胃前相比，差异不显著（P＞0.05）；提示若引起CD4＋/CD8＋比例发生显著变化，需要进行延长灌胃时间或者增加灌胃剂量，该现象需要进一步的实验验证。研究发现灌胃CGMP 4h就会引起正常小鼠外周血T淋巴细胞亚群显著减少，因为短期内淋巴细胞增殖很少，可能原因是灌胃CGMP后，作为外来抗原的CGMP，引起肠道黏膜局部免疫，使外周血中的T淋巴细胞向外周免疫器官迁移，即淋巴细胞归巢（lymphocyte homing），外周血中的T淋巴细胞选择性的穿越毛细血管后微静脉（HEV），向外周淋巴器官定向迁移，造成外周血中T淋巴细胞减少。体内的淋巴细胞处于动态循环状态，由血液进入组织，再从组织进入血液；本实验室前期的研究结果显示，CGMP作为抗原通过肠相关淋巴组织和血液循环进入脾脏从而促进脾脏和PP结以及MLN中CD3＋和CD3＋CD4＋、CD3＋CD8＋细胞的显著增加[22]，这与本实验的结果和推断相一致。因此，CGMP灌胃后，短期内会引起外周血中淋巴细胞数量的减少；随后，由于淋巴细胞的再循环，抗原刺激T淋巴细胞分化、增殖，使得外周血中T淋巴细胞亚群比例回升至正常水平。当连续灌胃CGMP 2、4、6、8d的结果表明，到第2天，外周血T淋巴细胞亚群显著升高，CD3＋CD4＋/CD3＋CD8＋的比值增加。这说明CGMP对小鼠T细胞功能具有增强作用，随着天数的增加，淋巴细胞亚群的平衡逐渐趋于正常。因此该结果提示，如果连续给T淋巴细胞亚群失衡的模型小鼠灌胃CGMP，可能会促进外周血中CD3＋CD4＋/CD3＋CD8＋的比值处于正常的水平，但尚需进一步的研究验证。

4 结 论

本实验采用口服CGMP干预健康小鼠的方法，流式细胞术分析短期和连续干预后对外周血T淋巴细胞亚群的变化，发现乳源CGMP能够引起正常小鼠的外周血淋巴细胞亚群的变化，根据CGMP对外周血中T淋巴细胞亚群的影响，可以推断出CGMP能够改善免疫功能异常引起的疾病，调节机体T淋巴细胞亚群的平衡作用。如：腹泻型肠易激综合征或炎症性肠病患者外周血中CD4＋细胞和CD4＋/CD8＋比值显著降低。因此，CGMP可能对外周血T淋巴细胞亚群的失衡有缓解作用。

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Effect of Milk-De rived Casein-G lycomacropeptide on Peripheral Blo od T Lympho cyte Subsets in Mice

YE Lei, CHEN Qing-sen*, LI Wei, YAN Ya-li, ZHAO Pei, PANG Gua ng-chang, HU Zhi-he
(Tianjin Key Laboratory of Fo od Biotechnology, College of Biotechnology and Food S cience, Tianjin University of Commerce, Tianjin 300134, China)

Objective: Casein glycomacropeptide (CGMP) is a kind of peptide containing 64 amino acid residues, which has many physiological functions and unique nutritional properties. This study aimed to explore its effects on peripheral blood lymphocyte subsets in mice. Methods: After being by gavage given different doses of CGMP (30, 60, and 120 μg/d), healthy mice were tested for the changes of the peripheral blood lymphocyte by flow cytometry. Results: In the short-term gavage experiment, CGMP resulted in a significant decrease in the proporti on of CD3+, and after 12 h, it recovered to the level before oral administration; CGMP at 30 and 120 μg/d resulted in a significant decrease in the proportions of CD3+CD4+ lymphocytes and CD3+CD8+ lymphocytes in peri pheral blood after 4 h, while CGMP at 60 μg/d resulted in no significant change. In the long-term gavage experiment, CGMP resulted in a significant increase in CD3+ lymphocytes and CD3+CD4+ lymphocytes in peripheral blood at days 2 an d 4 (P ＜ 0.05). Com pared with the control group, CGMP at 120 μg/d resulted in a significant increase in CD3+CD8+ lymphocytes in peripheral blood (P ＜ 0.05), but at 30 μg/d caused no significant increase (P ＞ 0.05). Moreover, at day 2, CGMP at the two dosages resulted in a significant increase in CD3+CD4+/ CD3+CD8+ in peripheral blood (P ＜ 0.05). Conclusion: CGMP can cause peripheral blood lymphocyte subsets to change in mice, and regulate the balance of T lymphocyte subse ts in peripheral blood. Therefore, CGMP can be used as a functional food to relieve the imbalance of T lymphocyte in p eripheral blood.

case in glycomacropeptide (CGMP); lymphocyte subse ts; CD4+ cells; CD8+ cells; func tional food

TS201.4

A

1002-6630（2014）11-0209-06

10.7506/spkx1002-6630-201411042

2014-02-09

国家自然科学基金面上项目（30771524；31071522）

叶雷（1989—），男，硕士研究生，研究方向为生物活性物质与肠道健康。E-mail：yelei20081020@126.com

*通信作者：陈庆森（1957—），男，教授，硕士，研究方向为食源性生物活性物质与肠道健康，蛋白质（酶）资源。E-mail：chqsen@tjcu.edu.cn