鸭疫里氏杆菌病的诊断与药敏试验

郝菊秋 董新荣 高德臣

鸭疫里氏杆菌病的诊断与药敏试验

郝菊秋①董新荣②高德臣①

（①辽宁职业学院 辽宁 铁岭 112099 ②山东滨州博莱威生物技术有限公司）

鸭疫里氏杆菌病是由鸭疫里氏杆菌(Riemerella anatipestifer，RA)引起雏多种禽类感染发病的病原，对1~7周龄的鸭危害最大，呈急性或慢性败血症。目前该病广泛分布于我国各地区，几乎所有的商品鸭场都有不同程度的感染，成为危害养鸭业最为严重的传染病之一。2013年6月，辽宁省某鸭养殖场共有25日龄雏鸭280羽，有90余羽鸭患病，病死率可达45%左右。养殖场主送检病鸭3只，剖检怀疑为鸭疫里氏杆菌病，进行了实验室的诊断，并进行了药敏试验，确诊为鸭疫里氏杆菌病。现报告如下。

1 病理剖检变化

全身浆膜以及肝脏表面、心包膜、气囊有纤维素性渗出物附着，心包膜增厚，心脏、脾脏肿大，肝质脆，肿胀、呈棕红色或土黄色。脑膜出血、充血、脑积液增多、水肿。关节液增多，单侧或双侧跗关节水肿。

2 细菌的分离培养与纯化

（1）取3只病死鸭剖检后，无菌取脑部组织分别接种血平板培养基和麦康凯养基板，麦康凯平板培养基直接放入37℃温箱培养，血平板培养基放入厌氧罐中37℃温箱培养。过夜后观察。观察结果，3份病料的血平板培养基中长出均一透明菌落，麦康凯平板中没长出菌落。将培养好血平板取出，挑取单个菌落，革兰氏染色后镜检观察。结果均为革兰氏阴性小杆菌。将鉴定为革兰氏阴性小杆菌的血平板，挑选单个菌落，继续划线培养纯化，收集菌液保存备用。（2）无菌取肝脏组织，分别接种麦康凯平板培养基，放入37℃温箱培养，过夜。观察结果，麦康凯平板培养基中没长出菌落。分离培养的细菌经鉴定符合鸭疫里氏杆菌的培养特性和染色特性。

3 PCR鉴定

将合成的RA特异性引物，直接加入菌液作为模板进行PCR鉴定。引物为P1：5'-ATGGTTCAGAGACTAAGC G-3'，P2：5'-ACGACTTAGCCCTAGTTACT-3'，扩增片段长度为643bp。引物由宝生物工程(大连)有限公司合成。PCR反应体系总体积为25μL：10×buffer2.5μL，MgCl22μL，dNTPs0.5μL，上、下游引物各0.25μL，rTaq酶0.25μL，DNA模板2μL，加水至25μL。PCR反应程序：95℃变性8min；94℃变性45s，61℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环后；72℃终延伸8min。将PCR产物经0.8%的琼脂糖凝胶电泳分析。经凝胶成像系统分析结果可见3样品均扩增出了643bp的特异性条带(见图1)。

图1 PCR产物琼脂糖凝胶电泳图谱

M为DL2000 Marker；1~3为3份细菌培养物的PCR产物；4为空白对照

4 生化试验

取分离的细菌接入蔗糖、乳糖、葡萄糖、半乳糖、果糖、木糖、山梨醇、甘露醇、甘露糖、麦芽糖生化反应管中，过夜观察结果。所有反应均为阴性，符合鸭疫里氏杆菌生化特性(见表1)。

表1 生化试验结果

5 玻片凝集试验

将鉴定为鸭疫里氏杆菌的病料进行玻片凝集试验，取纯化好的细菌，稀释在生理盐水中备用。分别吸取鸭疫里氏杆菌1、2、3、8、10型5种血清型各100ul滴到玻片上，再取稀释好的菌液100ul分别与5种血清型混匀，室温下静止放置10min后观察。结果均为血清型1型出现凝集反应，其他血清型未出现凝集。根据结果可以确定为此次分离的鸭疫里氏杆菌为血清型1型。

6 药敏试验

表2 药敏试验结果 （mm）

取纯培养细菌涂布血琼脂，均匀贴上药敏纸片，每个平皿5个药敏片，37℃厌氧培养24h，读取其抑菌圈计算平均值。判断标准为:抑菌圈直径小于10mm的为不敏感，10~15mm的为中度敏感，≥15mm的为高度敏感。根据表2可以看出对泰乐菌素、乙酰螺旋霉素、环丙沙星、新霉素、呋喃妥因、红霉素、阿莫西林、头孢噻肟敏感。对庆大霉素、万古霉素中敏。

7 结论

通过从疑似患鸭疫里氏杆菌病鸭场进行病料的分离培养、染色镜检、PCR鉴定、生化特性鉴定和血清型鉴定试验，确定为10型鸭疫里氏杆菌感染。

通过药物敏感性试验进行药物筛选，其中头孢噻肟、红霉素最为敏感，对万古霉素和庆大霉素中敏。因此可根据药敏试验选择敏感性药物进行治疗。

鸭疫里氏杆菌感染造成鸭养殖场巨大的经济损。我国各地流行的鸭疫里氏杆菌血清型多，且各地流行的血清型之间无交叉保护性，故本病的发生难于控制和预防，要预防鸭疫里氏杆菌病重要的是要加强饲养管理，分群饲养，饲喂营养丰富的饲料和注意消毒以提高雏鸭的抗病能力。本病发生后最好进行药物敏感性试验采用敏感性药物进行治疗，以达到较好的治疗效果，并要注意防止耐药菌株的出现。

（2014–04–07）

S858.32

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1007-1733(2014)08-0037-02