全脑缺血－再灌注对老年鼠海马区细胞凋亡与神经再生的影响

翁睿光 章剑剑 汪 琳

（1武汉市第五医院神经外科 武汉430050；2武汉大学基础医学院组织学与胚胎学教研室 武汉430071）

缺血后血流恢复可导致进一步的组织损伤和功能障碍，称为缺血－再灌注损伤。脑缺血引起细胞反应性损伤，是脑损伤的一种形式，再灌注后损伤加重。缺血－再灌注损伤由氧自由基堆积、炎性反应、谷氨酸和钙超载介导细胞毒性反应［1－3］。细胞凋亡是导致脑缺血－再灌注损伤的主要机制［4］，而中枢神经系统的神经再生能力影响神经组织损伤修复和功能恢复［5］。不同年龄阶段动物对缺血－再灌注损伤的病理生理反应不同，老年动物的反应更复杂［6］。本实验利用全脑缺血再灌注动物模型，比较缺血再灌注后，青年鼠（2月龄）老年鼠（18月龄）海马区齿状回神经组织的细胞凋亡与神经再生能力的变化。

材料和方法

1．实验动物和分组

2月龄青年雄性ICR小鼠15只，体重35－45g；18月龄老年雄性ICR小鼠15只，体重50－60g，动物来源武汉大学实验动物中心。采用随机数字分组法将实验动物随机分为青年假手术组、青年缺血－再灌注（I／R）组、老年假手术组和老年缺血－再灌注（I／R）组，I／R组动物随机分为I／R 3d组和缺血－再灌注I／R 7d组，每组5只动物。

2．主要试剂

兔抗－Bax多克隆抗体（SANTA CRUZ公司），抗－nestin单克隆抗体、抗－doublecortin（DEX）单克隆抗体、抗－caspase9单克隆抗体和抗－Bcl2单克隆抗体（CHEMICON公司），ECL检测试剂盒（Amersham公司）。

3．全脑缺血再灌注损伤模型的制备

全脑缺血再灌注模型采用二血管加低血压法制作，腹腔注射12%乌拉坦按1．0g／kg麻醉后，将小鼠仰卧固定，经颈正中切口，分离双侧颈动脉并套以“0”号丝线，将双侧颈动脉同时结扎阻断，解剖显微镜下观察动脉完全变白确定无血流通过，30min后切断丝线灌流10min，再次阻断30min后，放开线，使血流再通。阻断的同时，在距尾尖1．5cm处剪断放血，放血量小于体重的6%，以造成全脑低灌流，放血后热凝止血。术毕腹腔注射生理盐水1ml。假手术组的麻醉、手术和实验过程与完全相同，但不阻断颈总动脉，不放血。I／R组再灌注3d、7d后取材。

4．蛋白免疫印迹分析

各组动物断头处死，取脑组织，迅速分离海马组织，将各组动物的海马组织匀浆取上清，蛋白质样品进行SDS－PAGE后，转印至PVDF膜；正常血清封闭后分别与一抗、二抗孵育，ECL化学发光检测试剂盒显色反应后，拍照。

5．图像分析

采用凝胶成像系统进行光密度测定分析，以目的条带与内参β－actin的平均光密度比值表示目的蛋白相对表达水平，每组数据来自至少3次独立实验，计算平均值。

6．统计学处理

实验结果以均数±标准差（¯x±s）表示，利用SPSS16．0统计软件对均数进行方差分析。组间比较采用t检验，P＜0．05为差异具有统计学意义。

结 果

1．缺血－再灌注对海马区细胞凋亡的影响

蛋白免疫印迹结果显示：青年组海马区Bcl－2表达较老年组高（P＜0．01），与假手术组比较，青年组和老年组缺血－再灌注后，海马区Bcl－2表达降低，I／R 3d组明显降低（P＜0．01）；（图1）。老年组海马区BAX表达较青年组高（P＜0．05）；与假手术组比较，缺血－再灌注3d后（I／R 3d），海马区BAX表达显著升高（P＜0．01）（图2）。与假手术组比较，老年组缺血－再灌注后海马区caspase－9表达升高，I／R 3d组显著升高（P＜0．01）；缺血－再灌注3d（I／R 3d组）老年组海马区caspase－9表达较青年组高（P＜0．01）（图3）。

图1 缺血－再灌注后，海马组织中Bcl－2的表达（¯x±s，＊P＜0．01，＊＊P＜0．05）。免疫印迹Fig．1Expressions of Bcl－2in the hippocampus after I／R（¯x±s，＊P＜0．01，＊＊P＜0．05）．Western blot．

图2 缺血－再灌注后，海马组织中BAX的表达±s，＊P＜0．01，＊＊P＜0．05）。免疫印迹Fig．2Expressions of BAX in the hippocampus after I／R±s，＊P＜0．01，＊＊P＜0．05）．Western blot．

图3 缺血－再灌注后，海马组织中Caspase－9的表达（±s，＊P＜0．01，＊＊P＜0．05）。免疫印迹Fig．3Expressions of Caspase－9in the hippocampus after I／R（±s，＊P＜0．01，＊＊P＜0．05）．Western blot．

2．缺血－再灌注对海马神经元再生的影响

蛋白免疫印迹结果显示：与假手术组比较，青年组缺血－再灌注后，海马区nestin表达I／R 3d升高（P＜0．05），I／R 7d显著升高（P＜0．01）；老年鼠缺血－再灌注后nestin表达未见明显变化（P＞0．05）；与老年组比较，青年组（I／R 3d，I／R 7d组）海马区nestin表达显著升高（P＜0．01）（图4）。青年组海马区DCX表达较老年组高（P＜0．01）；与假手术组比较，青年组缺血－再灌注后DCX表达降低（P＜0．01），I／R 7d组较I／R 3d组升高（P＜0．05）；老年组缺血－再灌注后DCX表达无显著差异（P＞0．05）（图5）。

图4 缺血－再灌注后，海马组织中nestin的表达（±s，＊P＜0．01，＊＊P＜0．05）。免疫印迹Fig．4Expressions of nestin in the hippocampus after I／R（¯x±s，＊P＜0．01，＊＊P＜0．05）．Western blot．

图5 缺血－再灌注后，海马组织中DCX的表达±s，＊P＜0．01，＊＊P＜0．05）。免疫印迹Fig．5Expressions of DCX in the hippocampus after I／R（x±s，＊P＜0．01，＊＊P＜0．05）．Western blot．

讨 论

Bax和Bcl－2是Bcl－2基因家族中一对重要的促凋亡因子和抑凋亡因子。Bcl－2通过阻断细胞凋亡而促进细胞存活，维持细胞生存；而Bax与Bcl－2功能相反，可形成同源二聚体，作为线粒体膜上离子通道的组成部分，使细胞色素C得以穿过线粒膜，并在细胞质内参与形成凋亡启动复合体，激活caspase的级联反应，引发DNA断裂及多种细胞蛋白成分的破坏，最终导致细胞的凋亡。Bcl－2和Bax的表达强度决定细胞命运，Bax占优势时促进细胞死亡，Bcl－2占优势时阻止细胞死亡。高表达的Bcl－2可使去除神经生长因子的交感神经元继续存活，而Bax的过表达则能对抗Bcl－2对细胞凋亡的抑制作用［7］。Bcl－2与Bax表达的比例决定着细胞在受到凋亡刺激信号后是生存还是死亡，因此调节二者基因表达对脑缺血具有重要的治疗潜力［8］。本实验结果发现脑缺血－再灌注导致青年组和老年组动物海马区Bax，caspase－9表达升高，Bcl－2降低，证实细胞凋亡是引起神经元损伤的主要原因；脑缺血－再灌注导致的Bax表达升高，老年组明显高于青年组，提示老龄增强海马区对缺血－再灌注损伤导致的细胞凋亡反应。

成年哺乳动物，包括鬛齿类、灵长类和人海马齿状回颗粒细胞下区有神经干细胞分布，成体神经干细胞始终保持有增殖能力，并且能诱导分化神经细胞系［9］，海马齿状回神经再生能力随年龄增长降低［10］。脑缺血能促进成体神经干细胞增殖、分化，由成神经区向缺血灶迁移，提示脑缺血损伤具有自我修复的能力［11］。Nestin是一种中间丝蛋白，表达于未成熟的神经元，出生11d大鼠的脑皮质中nes－tin消失［12］；nestin在成体神经干细胞中有表达，与成体神经再生相关。Doublecortin（DCX）是一种微管相关蛋白，在鼠胚中枢神经系统有较高表达，表达于迁移中的成神经元细胞，与神经元塑性、轴突形成、突触建立相关［13］。因此，Nestin和DCX用以作为成体神经干细胞标记分子。成体海马齿状回神经再生经历五个阶段：成神经细胞增生，成神经细胞分化期，神经元移行，轴突和树突靶向，突触集成。Nestin作为神经再生标记表达于表达于成体神经再生早期，DCX的表达于神经元树突轴突延伸阶段［14］。本实验结果发现脑缺血－再灌注损伤导致青年组海马区nestin表达升高，老年组未见显著变化，提示老龄动物脑缺血－再灌注损伤的自我修复能力降低。缺血－再灌注3d，7d后DCX表达均低于假手术组，提示缺血－再灌注损伤影响神经元塑性，但青年组海马区DCX表达较老年组高，进一步证实老龄动物缺血－再灌注损伤后，海马区神经再生能力降低，影响组织损伤的自我修复能力。

综上所述，神经组织对缺血－再灌注损伤的修复决定于细胞凋亡、神经再生能力，随年龄增长，由于成体海马区神经再生能力降低，，因此缺血－再灌注导致老龄鼠海马区神经再生能力降低，细胞凋亡反应增强，影响组织修复和功能恢复。

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