猪场大肠杆菌灭活苗的制备

王亮

猪场大肠杆菌灭活苗的制备

王亮

（山东省安丘市畜牧局 262100）

2013年8月，山东省安丘市某猪场突然暴发仔猪黄白痢病，主要表现为一窝仔猪出生时体况正常，于12h之后，有一二头表现全身衰竭，很快死亡。以后其他仔猪相继发生腹泻，粪便呈黄色浆状，含有凝乳小片。捕捉时，在挣扎和呜叫中常由肛门冒出黄色稀粪，以后迅速脱水，衰竭而死。有的转为拉灰白色粘稠粪便为特征，致使仔猪发育停滞、消瘦、衰弱、抵抗力下降。惠丰猪场也曾用疫苗预防和药物治疗仔猪黄白痢，但效果不佳，给猪场带来严重经济损失。为此，从该猪场分离筛选出致病性大肠杆菌株制成铝胶苗用于该猪场后，仔猪黄白痢得到有效的控制。

1 材料与方法

1.1 材料

用灭菌棉签从该场典型黄白痢病仔猪肛门拭取20个粪样，置无菌试管中作为病料。麦康凯和伊红美蓝琼脂培养基(上海市医学化验所试剂厂)，产品型号20081224；20种大肠杆菌0抗原单价血清(中监所)；肠杆菌科生化编码鉴定管；铝胶佐剂(浙江省军区后勤部卫生防疫检疫所)，产品型号20090104。

1.2 试验动物

15~18日龄小鼠20只，健康家兔10只(杭州市萧山区兽医卫生防疫站)，免疫与非免疫2日龄仔猪各15只，妊娠母猪90头(惠丰猪场，均为3胎内的年轻母猪)。

1.3 纯菌株的制备

取病料分别于麦康凯和伊红美蓝琼脂平板划线，经37℃培养18~24h后，从麦康凯琼脂平板上钩取单个粉红色、圆形、稍隆起、边缘整齐、表面光滑的中等大小菌落或从伊红美蓝琼脂上挑取紫黑色、带金属光泽闪亮的疑似菌落，涂片，革兰氏染色，油镜镜检。将检出两端钝圆的G﹣短小杆菌再接种于麦康凯琼脂培养基上培养，37℃培养18~24h，重复2~3次，确认无杂菌后后分别移至琼脂斜面上，作为纯菌种。

1.4 菌种鉴定

1.4.1 生化试验 参考兽医微生物学及免疫实验指导的方法，将个菌株分别接种于葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露糖等糖的发酵生化管中做糖发酵试验；同时菌株分别做三糖铁试验、枸橼酸盐利用试验、吲哚试验、V-P试验、M．R．试验、尿素酶试验，设对照组并记录结果。

1.4.2 致病性试验 将生化鉴定后的菌株分别接种于普通肉汤，37℃培养18h后备用。取15~18g健康小鼠10只，分成2组，实验组和对照组个5只小鼠，试验组每只小鼠腹腔注射0.2ml疑似分离菌株肉汤培养液，对照组不注射，2组隔离饲养观察，每6h观察小鼠情况，选择致病小鼠的大肠杆菌菌株为该场致病菌株。

1.4.3 血清型鉴定 待检菌株的处理：将纯化的待检菌液涂布于普通琼脂平板上，于37℃恒温箱中培养18h后，用适量5g∕L石炭酸生理盐水洗下菌苔，制成浓稠菌悬液；121℃高压灭菌2h，破坏K抗原后即为待检菌的O抗原，4℃保存备用。血清学鉴定：按照鉴定血清说明书分别做玻板凝集和试管凝集实验，鉴定惠丰猪场猪大肠杆菌致病菌株血清型。

1.5 大肠杆菌灭活苗的制备

1.5.1 扩菌培养 用接种环分别钩取适量不同血清型的菌株，划线于营养琼脂平板表面，在37℃条件下培养24h后，以灭菌生理盐水洗下制成悬浊液；再取悬浊液均匀涂布于营养琼脂平板表面，在37℃条件下培养24h，以灭菌生理盐水洗下菌落。分别置于灭菌瓶中，用麦氏比浊管法测定其含菌数，使各血清型的菌液含菌数相等。

1.5.2 灭活 将不同血清型的菌株培养液混合，以灭菌生理盐水稀释至含细菌总数为200亿∕ml。加入甲醛溶液使其在菌液中的最终浓度为0.5%，37℃灭活24~48h，其间振荡数次。再加入等菌液体积20%灭菌氢氧化铝胶，最后加入柳硫汞使最终浓度为0.01%，混匀、检验、分装。

1.6 猪场大肠杆菌灭活苗的检验

1.6.1 性状和无菌检验 肉眼直接观察灭活苗性状；混匀并取适量灭活苗，均匀涂布于麦康凯琼脂平板上，37℃培养72h后观察及显微镜检查。

1.6.2 安全性检查 取10只小白鼠，分别皮下注射菌苗0.5ml∕只，连续观察7d；取10只家兔，皮下注射灭活苗2ml∕只，观察7d，期间每4h测1次体温；妊娠母猪10头，产前15d，肌肉注射4ml∕头，连续观察20d。

1.6.3 攻毒试验 随机选取免疫母猪和非免疫母猪所产2日龄仔猪各l5头，分别用制苗细菌悬液，按100亿∕头进行攻毒，观察仔猪哺乳期内的生长情况，记录仔猪发生黄白痢的头数和死亡情况，测定其对仔猪的保护率。

2 试验结果

2.1 糖发酵与生化试验结果

各菌均可发酵葡萄糖、乳糖、麦芽糖甘露醇，产酸产气；少数菌株发酵蔗糖，只产酸或产酸并产气；M．R．试验阳性；V—P试验阴性；产生靛基质；尿素酶试验阴性；硝酸盐还原试验阳性；吲哚试验阳性；枸橼酸盐利用试验阴性；三糖铁斜面、底层产酸变黄，有气体，无变黑现象。从惠丰猪场共分离到致病性大肠杆菌17株，用玻片凝集法进行血清型鉴定，结果为：O64(7株)，O9(4株)．0149(5株)．一株未知。

2.2 无菌检验

灭活苗静置后分层，上层为澄清液体，下层为乳白色沉淀物，振摇混匀呈均一浑浊液；麦康凯培养基上无菌生长。

2.3 安全性检查

试验用的10只小白鼠、10只家兔观察7d均无异常；产前15d妊娠母猪注射后部分母猪有一过性的厌食反应，注射部位轻微红肿，无其他不良反应，胎儿、新生仔猪在哺乳期内均正常。

2.4 攻毒试验

结果见附表。

附表 2日龄仔猪发病情况 （头、%）

组别仔猪数发病数发病率死亡数死亡率致死率 免疫组15320.00213.3566.67 非免疫组151386.67746.4661.62

由附表可以看出攻毒后免疫组新生仔猪在哺乳期内发病3头，其中2头死亡，死亡率和致死率分别为13.35%、66.67%。攻毒后对照组新生仔猪在哺乳期内发病13头，其中7头死亡，死亡率和致死率分别为46.46%、61.62%，差异显著(P<0.05)，说明灭活苗对哺乳期内的新生仔猪具有较好的保护作用。

（2014–02–24）

S8

B

1007-1733(2014)05-0064-02