维生素C对酮康唑抑制白色念珠菌的影响研究

张祥涛 于立权

维生素C对酮康唑抑制白色念珠菌的影响研究

张祥涛 于立权*

（山东联创建筑(矿业)设计有限公司 山东 济南 250000） （黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院 黑龙江 大庆）

为研究酮康唑治疗畜禽真菌感染过程中能否给与维生素C辅助治疗，体外测试了添加维生素C后白念珠菌对酮康唑的敏感性。结果发现，维生素C能显著抑制酮康唑对白色念珠菌的敏感性，为科学治疗畜禽机会性真菌临床感染提供了依据。

维生素C 酮康唑 白色念珠菌

白色念珠菌(Candida albicans)是临床重要的条件致病性真菌[1]，在兽医临床广泛存在。由于抗生素、皮质激素和免疫抑制剂等药物的广泛使用和滥用，以及用药消毒不严格、饲舍卫生差、畜禽营养不良等因素，像顽固性奶牛乳房炎[2]、奶牛子宫内膜炎[3]和禽消化道真菌病[4]等畜禽条件性念珠菌病越来越多，往往会造成误诊或漏诊，给兽医临床诊治带来严重困扰。

酮康唑属吡咯类抗真菌药，对深部感染真菌如念珠菌属等具有抗菌作用，是临床常用的抗真菌药[5]。L-抗坏血酸(VC)是一种水溶性维生素，可以保护如谷胱甘肽等抗氧化剂，发挥抗氧化作用[6]。为此，本文对抗坏血酸对酮康唑抑制白念珠菌的影响进行了研究，以期指导白念珠菌病的临床治疗，为畜禽白念珠菌病的防治提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 菌株和培养基 白色念珠菌RM1000，由黑龙江八一农垦大学生命院4056实验室提供；YPD培养基用胰蛋白胨和酵母提取物为OXOID公司产品，营养琼脂为北京奥博星生物技术责任有限公司产品。Vc为天津市博迪化工有限公司产品；谷胱甘肽(L-GSH，还原型)为山东西亚化学工业有限公司产品；酮康唑(KCZ)为成都贝斯特试剂有限公司产品。

1.2 培养基及试剂配制 液体YPD培养基(2%胰蛋白胨；1%酵母提取物；2%葡萄糖)，固体YPD培养基添加2%的琼脂粉，121℃灭菌20min备用。分别配制0.5M的Vc、0.5M的GSH和10μg/ml的KCZ贮存液，4℃保存备用。

1.3 菌株生长期测试 取白色念珠菌RM1000，无菌操作台内划线法YPD平板接种活化，标记后30℃恒温培养。挑新鲜单菌落接种于2-3ml YPD液体培养基中180rpm过夜培养后，按1:100(v/v)比例转接新鲜的YPD液体培养基，间隔2h取样，测OD600，共记录至58h。

1.4 添加Vc后菌株对KCZ的敏感性测试

按照上述方法，按照1:100(v/v)的比例接种菌液于新鲜的YPD液体培养基后，加入终浓度5mM的Vc和100ng/ml的KCZ(KCZ+Vc组)，分别在作用0、0.5、1、6、12、24、36和48h后，取1ml菌液，5000rpm离心后，1ml灭菌ddH2O重悬，取100ml重悬液加入到900ulddH2O中，充分漩涡后，取100ml悬浮液涂布于YPD平板，30℃培养，计数。同时，设置KCZ+Vc+GSH、Vc+GSH、Vc、GSH、KCZ和ddH2O 6个对照组。

2 结果

2.1 菌株RM1000不同生长期的确定 首先测试了白念珠菌RM1000菌株的生长期。结果发现，白念珠菌菌株RM1000在30h达到对数生长期，OD值达到最大值(图1)，为后续进行酮康唑敏感性测试实验奠定了基础。

图1 白色念珠菌菌株RM1000的生长曲线

2.2 体外添加Vc影响白念菌RM1000对KCZ的敏感性 参照公开发表的文献[7]，选用添加5mM Vc进行测试不完全杀死剂量(100ng/ml)的KCZ对白念珠菌RM1000的敏感性。结果发现，添加维生素C后，能够显著降低白念珠菌对酮康唑的敏感性。单独添加维生素C或还原型谷胱甘肽后，白念珠菌细胞增殖活力明显增强(图2)。

图2 维生素C对KCZ抑制白念珠菌RM1000的影响

3 讨论

唑类药物具有抗真菌谱广、副作用小和口服吸收好等优点，在临床上应用广泛。酮康唑通过干扰细胞色素P-450的活性，从而抑制真菌细胞膜主要固醇类-麦角固醇的生物合成，损伤真菌细胞膜并改变其通透性，以致重要的细胞内物质外漏，还可以抑制真菌的三酰甘油和磷脂的生物合成，抑制氧化酶和过氧化酶的活性，引起细胞内过氧化氢积聚导致细胞亚微结构变性和细胞坏死。谷胱甘肽是由谷氨酸、胱氨酸和甘氨酸组成的短肽，在体内有氧化还原作用。它有两种存在形式，即氧化型和还原型，还原型对保证细胞膜的完整性起重要作用。VC是一种强抗氧化剂，其本身被氧化，而使氧化型谷胱甘肽还原为还原型谷胱甘肽，从而发挥抗氧化作用[8]。为研究在畜禽感染白念珠菌疾病应用酮康唑治疗的过程中，是否可以饲料添加或口服给与维生素C辅助治疗来提高畜禽机体免疫力，通过体外添加维生素C的方法来测试白念珠菌菌株对酮康唑的敏感性，结果与前人的报道一致[7]，说明维生素C可能通过干扰过氧化氢的累积而影响着白念珠菌对酮康唑的敏感性，具体机制需要进一步研究。本研究结果为科学治疗畜禽机会性真菌临床感染提供了依据。

[1] 杨继君. 白念珠菌生物膜的形成及其耐药机制的研究进展[J]. 华中医学杂志, 2005, 29(3): 179-180.

[2] 孙英峰, 王英珍, 李秀丽等. 杨天骄奶牛真菌性乳房炎病原菌的分离鉴定及其致病性研究[J]. 中国奶牛，2009, 6: 33-35.

[3] 杜光波, 徐莉, 高梦宁. 奶牛子宫内膜炎主要病原菌的调查[J]. 畜牧与兽医, 2007,39(4): 24-26.

[4] 刘翠玲, 姜涛. 肉鸡白色念珠菌病的诊断与防治[J]. 养殖技术顾问, 2011, 12: 122.

[5] 于立权, 杨小雪, 张红红等. 金黄色葡萄球菌胞外分泌物对白念珠菌ptc2缺失株酮康唑敏感性的影响[J]. 黑龙江八一农垦大学学报, 2013, 25(1): 37-40.

[6] 许友卿, 易波, 丁兆坤. 维生素E和维生素C的协同抗氧化作用及对水产动物的影响[J]. 饲料工业, 2011,32(14): 59-62.

[7] Yan Wang, Xin-Ming Jia, Jian-Hui Jia, Ming-Bang Li, Ying-Ying Cao, Ping-Hui Gao, Wan-Qing Liao, Yong-Bing Cao and Yuan-Ying Jiang. ASCORBIC ACID DECREASES THE ANTIFUNGAL EFFECT OF FLUCONAZOLE IN THE TREATMENT OF CANDIDIASIS[J].Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology, 2009, 36, e40-e46.

[8] 朱长林, 张文彬, 孙鹏等. 维生素C与维生素E的联合免疫调节及抗氧化作用[J]. 中国临床康复, 2006, 10(36):120-122.

（2014–02–20）

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1007-1733(2014)05-0004-02