气相色谱法测定奶茶中的反式脂肪酸

周红霞 华 春 阮 鸣 贾政华 沈 娟

(南京晓庄学院生物化工与环境工程学院1 ，南京 211171)(江苏省农产品质量检验测试中心2，南京 210036)

反式脂肪酸(Trans Fatty Acids，TFA)又名氢化脂肪酸，是所有含有反式双键的不饱和脂肪酸的总称。大量研究证明， 反式脂肪酸的摄入会对人体健康产生不利影响，如影响必需脂肪酸的消化吸收、 导致心血管疾病的发生、抑制婴幼儿生长发育等[1-3]，还会导致癌症、肝功能失调、肥胖，还会造成妇女不育[4-6]。国际上极为重视食品中反式脂肪酸的检测与标识，反式脂肪酸的研究已受到国外学者的高度重视。美国早在1993年已经拉开了对反式脂肪酸的研究序幕，现今丹麦、法国等已对反式脂肪酸限量进行了立法[3]。在中国，反式脂肪酸并未引起人们的广泛重视。反式脂肪酸的加工食品有很多，油炸食品，如薯条、油条、油酥饼；咖啡伴侣或速溶咖啡；薯条、薯片等。国内关于反式脂肪酸的研究数据并不多[7-9]，尤其是对奶茶TFA的检测。曹君等[4]用气相色谱法测定了目前市面上常见奶茶品种中脂肪酸组成，并对其中的危害因子TFA 含量进行分析。目前，食品中反式脂肪酸的检测方法主要有：气相色谱法(GC)、红外光谱法(IR)、薄层色谱法(TLC)等，其中研究较多的是气相色谱法。已有资料表明，不同色谱条件对反式脂肪酸的分离效果不同，关键问题是不能完全分离顺/ 反式烯酸异构体[10-17]。本研究对奶茶中的反式脂肪酸经三氟化硼甲醇甲酯化处理后，用气相色谱法测定了其中41种混合脂肪酸，旨在将41种混合脂肪酸甲酯得到相对满意的分离，尤其是反式脂肪酸与其他组分分离，并能准确对常见反式脂肪酸进行定性定量，以满足日常安全检测的需要。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

10种奶茶：市售; 正庚烷(色谱纯)、三氟化硼甲醇、乙醇、焦性没食子酸、乙醚、无水硫酸镁、氢氧化钾、甲醇均为分析纯：国药集团化学试剂有限公司；反式脂肪酸甲酯标准品溶液，如反十四碳一烯酸甲酯(5tC14∶1)、反十六碳一烯酸甲酯(7tC16∶1)、反油酸甲酯(9tC18∶1)、反异油酸甲酯(10tC18∶1)、反异油酸甲酯异构体(11tC18∶1)、反亚油酸甲酯(6tC18∶2)、反二十碳一烯酸甲酯(9tC20∶1)、反二十二碳一烯酸甲酯(9tC22∶1)：美国 NuChek-Prep公司。

1.2 仪器与设备

VARIAN CP-380气相色谱仪：美国VARIAN公司；WH-2微型漩涡混合仪：上海沪西分析仪器厂有限公司； HP-88(100 m×0.25 mm×0.20 μm)毛细管色谱柱：美国 Agilent 公司。

1.3 方法

1.3.1 脂肪提取[6]

参照国标GB/T 22223—2008方法，将其中脂肪的水解由碱水解改为酸水解法。称取1 g样品移入到250 mL烧瓶中，加入约100 mg焦性没食子酸和2 mL无水乙醇，混匀后加入10 mL盐酸，混匀。将烧瓶放入70～80 ℃水浴40 min后冷却至室温。加入10 mL 95%乙醇，混匀。将溶液转移至分液漏斗中，加入50 mL乙醚加盖，振摇5 min，静置10 min，将乙醚层提取液收集到250 mL烧瓶中，以上步骤重复3次。挥发溶剂，残留物即为脂肪提取物。

1.3.2 脂肪的皂化和脂肪酸的甲酯化[6]

在脂肪提取物中加入2%氢氧化钠溶液8 mL， 80 ℃水浴上回流至油滴消失，加入7 mL 15%三氟化硼甲醇溶液，80 ℃水浴回流2 min后冷却烧瓶至室温，加入10 mL正庚烷，振摇2 min，加入饱和食盐水溶液，静置分层，吸取上层正庚烷提取液5 mL至试管中，加入约3～5 g无水硫酸钠，振摇1 min，静置5 min，吸取上层溶液到进样瓶中待测定。

1.4 色谱分离条件[4]

色谱仪：VARIAN CP-3800；检测器：氢火焰离子化检测器FID；色谱柱：HP-88 毛细管柱(100 m×0.25 mm×0.20 μm)；色谱条件：气化室温度：250 ℃；柱温：150 ℃(10 min)-5 ℃/min-230 ℃(40 min)；检测器温度：260 ℃；氮气：1 mL/min；氢气：30 mL/min，空气： 300 mL/min。

1.5 色谱测定[2]

对照品检测：取1 μL脂肪酸甲酯混合标准溶液注入气相色谱仪，在上述色谱条件下测定标准溶液的峰面积，得到每个脂肪酸甲酯的相对保留时间和气相色谱图，计算出分离度。

样品检测：取1 μL酯化好的样品溶液注入气相色谱仪，在上述色谱条件下测定试样的峰面积。经过与标准溶液谱图比较峰面积得到样品中脂肪酸甲酯的含量。

2 结果与分析

2.1 色谱分离情况

食品中常见的反式脂肪酸主要包括5tC14∶1、7tC16∶1、9tC18∶1、6tC18∶2、9tC20∶1、9tC22∶1 6类，但总脂肪酸成分很复杂，包括饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸，其中, 不饱和脂肪酸又分为顺式不饱和脂肪酸和反式不饱和脂肪酸[4]。正是由于反式脂肪酸的种类及其空间异构体繁多，对它们各组分的分离及官能团定位等方面存在技术上的困难，反式脂肪酸含量的测定难点在于能将顺、反异构体分离。

取1 μL脂肪酸甲酯混合储备液标准溶液注入气相色谱仪。色谱分离情况如图1，色谱系统评价见表1。

图1 脂肪酸甲酯分离情况

表1 多组分脂肪酸甲酯色谱分离保留时间与分离度

序号名称保留时间/min理论塔板数/m分离度1C4∶019．535515105302C6∶020．30926631837．13C8∶021．614352463110．04C10∶023．674470881617．05C11∶025．006536066511．06C12∶026．517605895313．07C13∶028．205658387515．08C14∶030．011716543815．095tC14∶130．99174937568．410C14∶131．54274350974．711C15∶031．88282069382．912C15∶133．478810446213．013C16∶033．79984569362．7147tC16∶134．70287486617．515C16∶135．74085104123．916C17∶037．19792801294．517C17∶137．738917487011．018C18∶037．73894014234．3199tC18∶138．53175964815．82010tC18∶138．62862872980．62111tC18∶138．73465765600．722C18∶139．10194101082．6236tC18∶240．00794807756．824C18∶241．14394987408．425C20∶041．99996979446．226C18∶342．74388891835．2279tC20∶143．03298973112．028C20∶143．6090N/A29C18∶343．6723623156N/A30C21∶044．36297988733．631C20∶246．0888918280N/A32C22∶047．00189858655．733C20∶348．10483580986．6349tC22∶148．31689856561．335C22∶149．05494541504．536C20∶349．25781872171．237C20∶449．74177457302．738C23∶049．95086941161．239C22∶252．254816810712．040C24∶053．37378714155．841C24∶156．118749073712．0

本试验采用100 m长HP-88毛细管石英柱色谱柱进行多组分脂肪酸快速分离，由图1、表1中可以看出41种混合脂肪酸56 min内得到完全分离。其中， 9tC18∶1、6tC18∶2、出峰时间分别为38.531 min和40.007 min，各组分理论塔板数均大于40 000，分离度基本大于1.5，完全可以满足食品中反式脂肪酸的检测要求。另外，从图1中还可以看出在本色谱条件下各脂肪酸甲酯出峰顺序有一定的规律：饱和脂肪酸甲酯出峰顺序与碳链长度有关系，碳链越长出峰越迟，如C12∶0先于C15∶0；相同碳链脂肪酸甲酯不饱和度越大，保留时间越长，C18∶0保留时间短于6tC18:2；而顺反异构的不饱和脂肪酸甲酯是反式先出峰，顺式后出峰，如9tC18∶1先于C18∶1出峰[5-6]；同一异构体的不饱和脂肪酸，稀键所在碳原子数序号大的色谱峰居于序数小的之前[2]，如9tC18∶1保留时间短于10tC18∶1，10tC18∶1保留时间短于11tC18∶1；但这几种异构体保留时间相差很小(表1)，分离度不好，这是因为他们的结构非常相似，仅不饱和键的位置不同。

2.2 方法线性关系和精密度

分别配制5、10、20、50、100 μg/mL系列标准溶液溶液，进样1 μL，记录色谱图，并以浓度对峰面积计算各组分回归方程，对20 μg/mL样品，连续进样5次，计算RSD，结果见表2。 由表2可看出，在质量浓度为5～100 μg/mL浓度范围内线性良好，各脂肪酸RSD小于3.1%，符合外标法要求，精密度较好。

表2 几种反式脂肪酸的标准曲线

2.3 最小检测限

以基线信噪比3∶1所对应的浓度为方法的最小检测限。将10 μg/mL对照品溶液稀释5倍，即含5tC14∶1、7tC16∶1等皆为2 μg/mL的溶液进样测得信噪比为3∶1，则各组分的最小检测质量浓度为2 μg/mL，满足检测要求，结果见表2。

2.4 回收率试验

向3份原味奶茶样品中分别加入不同量的5tC14∶1、9tC18∶1 标准品，检测结果见表3。

表3 回收率试验结果

2.5 样品检测

由于食品中脂肪酸以脂肪酸三酰甘油形态存在，在计算反式脂肪酸时需将脂肪酸甲酯转变为脂肪酸三酰甘油的形式，但是当碳数≥8时，脂肪酸甲酯和脂肪酸三酰甘油的转换系数Tri/FAME>0.99[8]，因此可用反式脂肪酸甲酯的含量代替反式脂肪酸的含量。将所采集的样品按1.3.1，1.3.2进行处理，进样1 μL，记录相应的色谱图。分析其中反式脂肪酸，图2为奶茶样品色谱情况。

图2 奶茶样品色谱情况

由图2看出，本试验条件下，在41 min内基本出峰， 经过计算，反式脂肪酸含量见表4，可见奶茶中均含有反式脂肪酸，且主要以9tC18∶1为主。

表4 奶茶中反式脂肪酸含量

3 结论

3.1 本研究采用HP-88毛细管石英柱(100 m×0.25 mm×0.20 μm)，实现了41种脂肪酸甲酯的有效分离，具有成本低、效率高、快速准确的优点。本方法适用于奶茶类饮品营养标签的快速测定。

3.2 在此试验条件下，8种反式脂肪酸的线性范围均为5～100 μg/mL，相关系数为0.999 1，检出限为2 μg/mL，加标回收率在86.9%～91.0%之间，相对标准偏差小于3.1%。

3.3 对产检市售奶茶检测发现，奶茶中基本都含有反式脂肪酸，尤以红枣味蒙古奶茶和经典奶茶为最，这对市民在购买奶茶类饮品的时候有一定的指导意义。

3.4 本方法将国标法中脂肪的水解由碱水解改为酸水解法，有效破坏了乳制品中的脂肪球，提高了脂肪提取率。

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