幽门螺杆菌Tipα蛋白对巨噬细胞凋亡的影响

伍美兰，刘胜，钟轶，杨晓春，刘丽维，张艳

（1.南华大学病原生物学研究所，湖南 衡阳 421001 E－mail：wumeilanh＠126.com；2.湖南省邵阳医学高等专科学校附属医院检验科，湖南 邵阳 422000）

幽门螺杆菌（Helicobacter pylori，Hp）是寄生于胃黏膜上皮细胞间沟及胃小凹内地一种革兰阴性细菌。Hp在人群中的感染率很高，尤其是在发展中国家，其感染率可达80%。Hp是引起胃黏膜疾病以及胃癌的重要病原体，其致病因素可能与黏膜表面炎症反应、分泌毒力蛋白等因素有关。肿瘤坏死因子α诱导相关蛋白（Tipα）是近年发现的一个新的毒力蛋白。研究发现，Hp的致病与Tipα关系密切［1－2］。本研究旨在观察Tipα对巨噬细胞细胞凋亡的影响。

1 材料与方法

1.1 主要实验材料 无内毒素的Tipα重组蛋白为本课题组制备。Annexin－V－FITC－PI检测试剂盒，Caspass－3、Caspase－9活性检测试剂盒购自南京凯基生物有限公司。细胞色素C ELISA 检测试剂盒购自欣博盛生物有限公司。THP－1 细胞购自中科院上海细胞库。

1.2 细胞培养与处理 人单核细胞THP－1 采用RPMI－1640培养基培养，并用PMA 诱导分化成巨噬细胞。置于37℃、5%CO2环境中培养。待细胞生长满孔底90%左右时，加入0、5、10、30、50μg／ml Tipα作用24h。

1.3 流式细胞术分析 流式细胞仪检测：激发波长Ex＝488 nm，发射波长Ex＝530nm；Annexin V－FITC 绿色荧光通道（FL1）检测，PI红色荧光通过PI通道（FL2或FL3）检测。荧光补偿调节：使用未经凋亡诱导处理的正常细胞作为对照荧光补偿调节去除光谱重叠和设定十字门位置。

1.4 Caspase－9、Caspase－3活化程度的检测 按照试剂盒操作步骤进行。裂解处理后细胞，吸取50μl（含100～200μg）蛋白，加入等体积2×Reaction Buffer和5μl Caspase－9Substrate／Caspase－3Substrate并于37 ℃避光孵育4h。在λ＝405nm 处测定其吸光值。通过计算OD 诱导组／OD 阴性对照的倍数来确定Caspase－9、Caspase－3活化程度。

1.5 细胞色素C 测定 按照欣博盛公司ELISA 测定试剂盒的说明进行。分别将标本或不同浓度标准品（200μl／孔）加入相应孔中，加入生物素化抗体工作液后28 ℃孵箱孵育120 min。洗板3次后，除空白孔外，加入酶结合物工作液（100μl／孔），37 ℃孵箱孵育25min；充分洗涤后分别加入显色剂，加入终止液，混匀后于3min内测量OD450值。

1.6 统计学方法 应用SPSS 13.0 统计软件进行统计学处理，数据以（±s）表示，实验组与对照组比较采用成组t检验。P ＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Tipα对巨噬细胞细胞凋亡的影响 Annexin V－FITCPI染色结果显示，流式细胞术结果显示巨噬细胞细胞阴性对照组细胞凋亡率仅（3.5±1.7）%。而经5、10、30、50g／ml Tipα处理后，细胞凋亡率分别为（7.65±2.15）%、（10.52±3.1）%、（16.21±2.80）%和（22.58±1.58）%。与对照组相比，差异有统计学意义（P ＜0.05）。

2.2 Tipα对Caspase－9 和Caspase－3 活性的影响 5、10、30、50μg／ml Tipα可明显增强巨噬细胞细胞中Caspase－9 和Caspase－3活性。且随着浓度的增高，Caspase－9 和Caspase－3活性逐渐增强，见表1。

表1 不同浓度Tipα对Caspase－9和Caspase－3活性的影响（相对活性）

2.3 Tipα对细胞色素C 释放的影响 ELISA 结果显示，Tipα诱导巨噬细胞释放的细胞色素C 的含量与Tipα的浓度呈浓度依赖性，即随着Tipα浓度的增高，细胞色素C 含量逐渐增多，与对照组相比有统计学意义（P ＜0.05）。

3 讨论

Hp本身是一种非侵袭性细菌。它对宿主细胞的致病作用主要是通过分泌一些酶和毒素而实现的。Tipα（又名HP0596）是Hp中所特有的基因。生物信息学显示，该蛋白具有脂蛋白框，因此可能是一种外周膜蛋白。也有研究显示，Tipα可以通过NF－κB途径诱导巨噬细胞分泌TNF－α、IL－6和IL－1β。但Tipα在Hp致病过程中究竟具有何种的潜在作用，是否能引起巨噬细胞凋亡，目前仍不完全明了。本研究证实体外重组表达的Tipα可激活巨噬细胞细胞内Caspase－9和Caspase－3活性，并能促进细胞色素C的释放，最终促进巨噬细胞细胞凋亡。

目前认为细胞凋亡的途径主要有死亡受体途径和线粒体途径。死亡受体途径是指细胞膜上的死亡受体Fas、TNFR 和TRAILR 等，与相应的配体结合后，并通过一系列半胱天冬氨酸蛋白酶（Caspase）的级联激活反应诱导凋亡的发生；线粒体途径则是指细胞在各种损伤因素刺激下，使线粒体膜透性增加，线粒体内某些与凋亡相关的物质，如细胞色素C 被释放出来，随后激活Caspase－9和Caspase－3，产生细胞凋亡效应［3－5］。

本研究证实，Tipα可能通过线粒体途径诱导巨噬细胞细胞凋亡。这可能是Hp诱导胃相关疾病发生的一个重要机制，在随后研究中，我们将对死亡受体途径开展进一步探讨。

［1］ 程平，施瑞华，张红杰，等.幽门螺杆菌毒素蛋白Tipα对人胃黏膜上皮细胞株GES－1 的影响［J］.中华医学杂志，2008，88（22）：1528－1532.

［2］ 岳俊杰，谭明峰，李北平，等.幽门螺杆菌TNF－α诱导蛋白的生物信息学分析［J］.计算机与应用化学，2009，26（1）：17－20.

［3］ 张杰，佘菲菲.幽门螺杆菌侵袭研究进展［J］.中外医学研究，2012，10（7）：146－148.

［4］ 赵莉萍，胡咏梅.幽门螺杆菌诱导大鼠胃上皮细胞凋亡与一氧化氮相关性研究［J］.蚌埠医学院学报，2013，38（7）：784－786.

［5］ 祁晓莉，戴洁，乔星，等.胃癌变过程中幽门螺杆菌感染与Ki67和P27蛋白表达的意义［J］.临床和实验医学杂志，2013，12（21）：1711－1714.