SAFE与SDE法对金华火腿皮下脂肪气味活性物质研究

刘笑生， 刘建斌， 刘梦雅， 何聪聪， 杨政茂， 宋焕禄

（北京工商大学分子感官科学实验室，北京 100048）

SAFE与SDE法对金华火腿皮下脂肪气味活性物质研究

刘笑生， 刘建斌， 刘梦雅， 何聪聪， 杨政茂， 宋焕禄*

（北京工商大学分子感官科学实验室，北京 100048）

通过溶剂辅助风味蒸发系统（SAFE）和同时蒸馏提取技术（SDE）与气相色谱-嗅闻仪-质谱联机法（GC-O-MS）结合，对已发酵18个月的金华火腿皮下脂肪气味化合物进行定性定量分析和感官评价.SAFE和SDE法分别检测并嗅闻到40种和22种气味活性化合物，对脂肪气味贡献度较大的10种关键性化合物分别是：己醛、庚醛、二异丙基二硫醚、辛醛、反-2-辛烯醛、3-甲基丁酸、反，反-2，4-癸二烯醛、γ-癸内醋、γ-十一内醋和苯乙酸.

SAFE；SDE；金华火腿皮下脂肪；气味活性物质

作为我国传统的腌腊制品，“金华火腿”以其独特的工艺，严格的选料和精细的制作方法造就出了自身皮薄骨细，腿心饱满，形似竹叶的优良特征，并且更以其独特的色、香、味享誉海内外.金华火腿中的香味是由肌肉组织和脂肪组织中挥发性气味成分协同影响的结果.在脂肪组织中，脂质主要以甘油酯、磷脂和游离脂肪酸的形式存在，随着火腿发酵程度的加深，这些物质通过脂肪酸降解、氧化以及美拉德反应等进一步生成挥发性物质.这些挥发性成分最终形成了火腿皮下脂肪的特征风味［1］.

目前，干腌火腿的气味检测中，样品的前处理方式种类很多，如固相微萃取技术（solid phase microextraction，SPME）［2-5］，动态顶空制样技术（dynamic headspace sampling，DHS）［6-8］，同时蒸馏提取技术（simultaneous distillation extraction，SDE）［9-11］和超临界流体技术［12］等前处理方法.而在金华火腿的风味研究中，应用最为广泛的是固相微萃取技术，如章建浩等［13］曾通过固相微萃取法对传统工艺下金华火腿的挥发性成分进行研究，赵改名等［14］通过SPME-GC-MS （solid phase microextraction-gas chramatograph-mass spectrography，SPME-GC-MS）法对金华火腿中挥发性气味物质的形成过程及变化规律进行了研究.在动态顶空技术中，宋焕禄［15］曾通过 DHS-GC-O-MS（dynamic headspace sampling-gas chromatograph-mass spectrography，DHS-GC-O-MS）法并结合DB-5和DB-WAX两类色谱柱对金华火腿关键香味化合物以及化合物的形成途径进行探索.在同时蒸馏提取的方法中，尹晓婷等［16］发现该方法在提取气味化合物的过程中，由于加热时间长并且受热强度大，金华火腿内部发生了Maillard反应，产生了一定量的醛类物质.在应用超临界流体对金华火腿风味物质检测方面，田怀香等［12］发现该技术对酸类物质提取率较高，对醛类、酮类提取率较低，并且对一些气味贡献度较大的物质，回收率不高.

作为顶空技术，SPME和DHS技术对气味物质的提取多集中于分子量较小的挥发性物质；在溶剂萃取技术中，SDE技术解决了对较高分子量的挥发性成分提取的问题，但由于对样品处理中需要高温加热，导致对原始食品风味的破坏，且会产生原来样品中没有、加热产生的后生物（artifact）.而作为一项新技术，溶剂辅助风味蒸发系统（solvent-assisted flavor evaporation，SAFE）于1999年由EngelW等［17］发明.SAFE是一种新型分离气味化合物的方法，它可以分为蒸馏系统和真空泵两个部分组成.通过SAFE得到的风味提取物能够在感官上表现出与被提物几乎一致的气味属性，并且对于复杂食品基质中的痕量挥发物有着良好的定量与定性效果［18-19］.

本实验采用SAFE和SDE分离并提取金华火腿风味成分，通过气相色谱-嗅闻-质谱仪（gas chromatography-olfactrometry-mass spectrometry， GC-OMS）对气味物质进行分析鉴定.

1 材料与方法

1.1 材料

金华火腿样品，金华金字火腿股份有限公司.金华火腿样品采用传统工艺制作，样品的发酵期已达18个月.取火腿外皮层下约1 cm处的脂肪部分50 g，并将其切成小块（约1 cm3）并用滤纸包好，装入索氏抽提装置中.

1.2 试剂与仪器

标准参考化合物，C7～C30的正构烷烃和内标物2-甲基-3-庚酮，色谱纯，美国Sigma公司.

7890A-Sniffer 9000-7000B型气相色谱-嗅闻-质谱联用仪，其中气相色谱仪，噢闻仪，质谱仪分别为美国 Agilent公司、瑞士 Brechbuhler公司、美国Agilent公司生产；DB-Wax（30m×0.25mm×0.25μm）型色谱柱，美国J&W公司；溶剂辅助风味蒸发装置，德国Glasbläserei Bahr公司；EXT75DX型复合涡轮分子真空泵，XDD1型机械泵，英国Edwards公司.

1.3 气味物质前处理方法

1.3.1 SAFE法处理样品

在索氏抽提装置中装入用滤纸包好的混合有内标物的50 g样品，内标物为2-甲基-3-庚酮，使内标质量比达到500 ng/g.在抽提装置下方连接的烧瓶中装入有机溶剂120 m L（乙醚80 mL，正戊烷40 mL），有机溶剂水浴加热的温度为45℃.将索氏抽提装置与恒温冷凝管相连接并设定冷凝水温度为15℃.索氏抽提5 h，得到淡黄色透明液体.

SAFE装置如图1［17，20-21］，将淡黄色透明液体注入滴液漏斗（1）中，并盖好瓶塞密闭，待用.将1 000mL的圆底烧瓶（2）置于水浴中加热（3），水浴温度保持45℃，收集黄色透明液体中的油相和水相.水浴入口（4）和水浴出口（5）处连接超级恒温水浴器，保证SAFE装置内部蒸馏头（6）和蒸馏腿（7）夹层水浴温度为45℃.分子涡轮泵与高真空入口处（8）相连接，使SAFE装置中的真空环境达到5×10-3Pa.冷阱（9）和250 m L的圆底烧瓶（10）置于盛放液氮的保温瓶（11）中，收集黄色透明溶液中的富含气味物质的有机溶剂.

图1 溶剂辅助风味蒸发系统装置示意Fig.1 Structure diagram of a SAFE instrument

将已分离出的有机溶剂经过无水硫酸钠干燥并通过Vigreux柱浓缩至2mL，用氮气吹扫至0.5mL，得到透明无杂质的浓缩液并进行GC-O-MS分析，每次进样量为1μL.

1.3.2 SDE法处理样品

在同时蒸馏提取装置的1 000mL烧瓶中装入混有内标物的50 g样品、沸石和500 mL蒸馏水，内标物为2-甲基-3-庚酮，使内标质量比达到500 ng/g. 在250mL的圆底烧瓶中加入120 mL有机溶剂（乙醚80 mL，正戊烷40m L）.1 000 m L和250m L烧瓶分别在150℃的恒温油浴锅和45℃恒温水浴锅中加热，样品加热至沸腾，同时蒸馏提取5 h后收集有机溶剂.将已分离出的有机溶剂经过无水硫酸钠干燥并通过Vigreux柱浓缩至2m L，用氮气吹扫至0.5 mL，得到透明无杂质的浓缩液并进行GC-O-MS分析，每次进样量为1μL.

1.4 GC-O-MS条件与AEDA分析

气相色谱柱温箱程序升温条件：初始温度40℃，保持时间3min，然后以5℃/min升至200℃，以10℃/min至温度230℃，保持3min.进样口温度为250℃，载气为He，流速为1.2m L/min，分流比1∶1.质谱条件，离子源温度230℃，电压70 eV，离子化方式为EI.灯丝发射电流35μA，扫描质量范围为45～650 m/z，扫描时间为200 ms，检测电压为350 V.嗅闻仪接口处的温度为200℃，载气为高纯氮气和水蒸气的混合气体.气味活性物质GC-O分析包括记录气味物质保留时间、强度和气味特征，由3名专业感官评价人员共同确定并完成.

芳香萃取物稀释分析（aroma extract dilution analysis，AEDA分析）时，浓缩液通过乙醚和正戊烷的混合液（比例为2∶1）按照1∶3的比例进行稀释，并将稀释后的浓缩液进行GC-O-MS分析，直到嗅闻口无法嗅闻到化合物气味为止，每个化合物的最高稀释倍数规定为其FD因子.

1.5 数据处理方法

未知化合物定性分析：化合物在GC-MS上的采集信息通过Masshunter Workstation B.03.01数据处理软件处理，在NIST谱库2.0中检索，确定未知化合物的信息并与该物质的气味特性、标准化合物保留时间和文献所报道的气味物质线性保留指数相比较，共同确定气味物质种类.线性保留指数（LRI值），以C7～C30正构烷烃作为标准并采用与待测样品相同的升温程序，计算出未知化合物的LRI值，并与标准LRI进行比对从而对物质进行定性.

气味化合物定量分析：气味物质的定量方法采用内标法定量，内标物采用2-甲基-3-庚酮.内标法计算公式：目标物浓度=内标物浓度×（目标物峰面积/内标物峰面积）.实验数据处理由SPSSStatistics 17.0和Microsoft Excel 2007数据处理软件完成.

2 结果与讨论

2.1 气味活性物质定性与定量分析结果

共检测并嗅闻到48种气味活性化合物，经分析鉴定出45种还有3种未知物，其中SAFE和SDE法分别检测到40种和22种气味物质（见表1）.烃类物质、硅氧化合物以及一部分苯系物由于并无特征气味未列在表中.在已鉴定出的45种气味物质中，醛类物质12种，醇类物质2种，酸类物质10种，酮类物质4种，酯与内酯类物质6种，硫醚类3种，含苯化合物6种，其他类物质2种.SAFE的气味物质种类明显高于SDE，但SDE大分子醛、酸检测中则要优于SAFE.定量结果中，SAFE中乙酸乙酯、甲苯、己醛、二异丙基二硫醚、乙酸、3-甲基丁酸和辛酸含量较高（≥1×10-6）.而SDE中乙酸乙酯、己醛、二异丙基二硫醚、反-2-辛烯醛、二丙基三硫醚、2-十一碳烯醛、反，反-2，4-癸二烯醛、γ-癸内酯、十六烷醛、十八烷醛、癸酸和月桂酸含量较高（≥1× 10-6），但含量高并不能说明其风味贡献度较大，需结合气味活性化合物稀释因子和OAV值具体分析.

2.2 GC-O分析结果

SAFE中气味化合物的特征风味强度明显高于SDE，见图2.在小分子酸和内酯类物质方面尤为突出，如丁酸（LRI，1596）、3-甲基丁酸（LRI，1638）、戊酸（LRI，1705）、γ-己内酯（LRI，1687）、γ-壬内酯（LRI，1890）、γ-癸内酯（LRI，2010）、γ-十一内酯（LRI，2127），这些物质在风味特征上具体表现在酸味、水果味和甜味方面.

火腿皮下脂肪关键性气味物质气味活性见表2，共有10种Log3FD≥3的关键气味化合物，化合物中贡献度较大的是二异丙基二硫醚和反，反-2，4-癸二烯醛，其次是反-2-辛烯醛、己醛、辛醛、庚醛等一些醛类，贡献度比较小的是一些酯类与酸类物质.此外，还有1-辛烯-3-酮，甲硫基丙醛，甲基（2-甲基-3-呋喃基）二硫醚等关键性气味化合物，这些化合物虽在色谱柱中未被检出，但嗅闻中强度较大，分别为火腿皮下脂肪贡献出了蘑菇味、土豆味、肉香，脂香等特征风味.通过对化合物定量并计算其OAV值可以发现，这10种气味物质的OAV≥1，表明这些化合物对皮下脂肪的风味组成均有直接影响.但表中气味物质的贡献度和嗅闻强度具有一定的出入，比如说，3-甲基丁酸、γ-癸内酯、γ-十一内酯、苯乙酸4种气味化合物在SAFE的检测结果中，Log3FD值均为最高，但其OAV值却普遍偏低，这可能是由于金华火腿皮下脂肪内部环境体系比较复杂，仅用文献报道中的单一环境下的阑值难以准确评价.因此，分析时应以香气强度直接表征气味化合物贡献度为主要分析方式，OAV值仅作为一种参考.

表1 金华火腿皮下脂肪GC-O-MS分析Tab.1 Analysis of odorants in subcutaneous fat of Jinhua hams by GC-O-MS

图2 火腿皮下脂肪气味活性化合物FD因子Fig.2 Thearomaintensity of active odorants in subcutaneous fat of Jinhua hams

表2 火腿皮下脂肪关键性气味物质气味活性值分析Tab.2 OAV of predominant odorants in subcutaneous fat of Jinhua hams

气相色谱-嗅闻（GC-O）结果如图3，共分为9种气味类型，分别为酸味，甜味，清新味，油脂味，坚果味，葱蒜味，水果味，鲜花味和其他气味.除坚果味外，SAFE的嗅闻强度结果远高于SDE.从图2可以看出，火腿皮下脂肪中的主体风味成分由油脂味、酸味和水果味构成.其中油脂味主要由一些直链醛和烯醛构成，如壬醛、癸醛、反，反-2，4-癸二烯醛和反-2-辛烯醛等；酸味主要由小分子酸构成，如乙酸、2-甲基丙酸、丁酸和戊酸等；水果味中贡献度比较大的是一些内酯类物质，主要体现在椰子和桃子味等方面，代表物质有γ-壬内酯、γ-癸内酯和γ-十一内酯等.鲜花味中，主要气味物质为苯乙醛、苯乙醇和苯乙酸，表现出玫瑰花香的特征；一些含硫化合物，如二异丙基二硫醚和二丙基三硫醚在嗅闻过程中表现出浓郁的葱蒜味；而坚果类特征风味主要体现在具有明显蒸煮土豆味的甲硫基丙醛上.清新味和甜味代表性化合物分别为小分子醛醇和酯，如代表清新口味的己醛、庚醛和己醇和代表甜味的γ-己内酯.其他类型气味中，如代表蘑菇味的1-辛烯-3-酮，具有木香味和生面粉味的反-4，5-环氧基-反-癸醛和具有芹菜味2-戊基癸酮等.

图3 不同前处理条件下脂肪中主体特征气味强度变化趋势Fig.3 Changes ofmajor characteristic aroma in subcutaneous fat of Jinhua ham

3 结 论

通过采用SAFE和SDE技术，对已发酵18个月金华火腿皮下脂肪风味进行分析，共发现48种气味活性物质.SAFE法和SDE法中分别发现40种和22种气味成分，可见SAFE法在能保证提取新鲜火腿脂肪中原始风味的同时，在气味物质种类上明显优于SDE法.在已鉴定出的45种气味物质中，醛类物质12种，醇类物质2种，酸类物质10种，酮类物质4种，酯与内酯类物质6种，硫醚类3种，含苯化合物6种，其他类物质2种.结合OAV值与GC-O嗅闻结果共确定10种关键性气味化合物，分别是己醛、庚醛、二异丙基二硫醚、辛醛、反-2-辛烯醛、3-甲基丁酸、反，反-2，4-癸二烯醛、γ-癸内酯、γ-十一内酯和苯乙酸.GC-O嗅闻结果表明：油脂味、酸味和水果味是构成金华火腿皮下脂肪特征风味的主体气味类型，表现在气味化合物中主要为直链醛类，小分子酸类和内酯类物质.

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Study on Odorants in Subcutaneous Fat of Jinhua Ham by SAFE and SDE M ethods

LIU Xiao-sheng， LIU Jian-bin， LIU Meng-ya， HE Cong-cong， YANG Zheng-mao， SONG Huan-lu*
（Laboratory ofMolecular Sensory Science，Beijing Technology and Business University，Beijing 100048，China）

The odor active compounds in subcutaneous fat of Jinhua ham fermented for 18 months were extracted by solvent-assisted flavorevaporation（SAFE）and simultaneous distillation extraction（SDE）methods and analyzed by gas chromatography-Olfactrometry-mass spectrometry（GC-O-MS）.Totally 40 odorantswere detected by SAFEwhile 22 odorantswere detected by SDE.About10 odorantswere identified as key odor active compounds，which were hexanal，heptanal，isopropyl disulfide，octanal，（E）-2-octenal，3-methylbutanoic acid，（E，E）-2，4-decadienal，γ-decalactone，andγ-undecalactone.

solvent-assisted flavourevaporation；simultaneous distillation extraction；subcutaneous fat of Jinhua ham；odor active compounds

檀彩莲）

TS201.3；O658.3；O657.7

A

10.3969/j.issn.2095-6002.2014.01.008

2095-6002（2014）01-0040-07

刘笑生，刘建斌，刘梦雅，等.SAFE与SDE法对金华火腿皮下脂肪气味活性物质研究.食品科学技术学报，2014，32（1）：40-46. LIU Xiao-sheng，LIU Jian-bin，LIU Meng-ya，et al.Study on odorants in subcutaneous fat of Jinhua ham by SAFE and SDEmethods.Journal of Food Science and Technology，2014，32（1）：40-46.

2013-07-24

“十二五”农村领域国家科技计划项目（2011AA100805-0-3）.

刘笑生，男，硕士研究生，研究方向为食品风味化学；*宋焕禄，男，教授，主要从事食品风味化学方面的研究.通讯作者.