加味苇茎汤及其成分芹菜素对肺腺癌A549 细胞增殖、周期与凋亡的影响

辛丽丽，姜 淼，许冬青，张 旭，陈 惠，龚婕宁

南京中医药大学，南京 210046

原发性支气管肺癌为最常见的恶性肿瘤，具有高发病率、高致死率的特点。非小细胞肺癌约占肺癌总数的80%，其中约1/2 为肺腺癌。肺腺癌易侵袭、易转移、易耐药，严重威胁着患者的健康。中医药通过多途径、多环节和多靶点治疗方式在肺癌综合治疗模式中的作用引起越来越广泛的关注，抗癌中药复方的开发及中药有效抗癌成分的提取已成为中医药治疗肺癌的重要途径。加味苇茎汤是南京中医药大学附属医院多年临床治疗肺癌的验方，尤其在肺癌早期，以清热活血为原则，合理应用该方可以有效改善患者的临床症状，提高生存质量［1］。本研究选择加味苇茎汤及相关成分芹菜素为研究药物，观察其对肺腺癌A549 细胞增殖、细胞周期及凋亡的影响，从而探讨该方药治疗肺癌的主要作用机制。

1 材料与仪器

1.1 动物与细胞株

健康新西兰兔10 只，雌雄不限，体重2.5～3.0 kg，由南京中医药大学实验动物中心提供，合格证号SCXK(苏)2007-0008;肺癌细胞A549，购自中国科学院上海研究院。

1.2 药物

加味苇茎汤:芦根、冬瓜子、苡仁、桃仁、虎杖、半枝莲，各药量比例为:10∶8∶10∶3∶10∶10，药材购自南京中医药大学国医堂门诊部，经中药专家鉴定属正品。常规煎煮浓缩为100%中药合剂，4 ℃冰箱保存备用。芹菜素(购自中检所)。

1.3 试剂与仪器

1640 培养液(Gibco，1171219);胎牛血清(Gibco，10099-141);胰蛋白酶(solarbio，T8150);MTT(solarbio，705B059);二甲亚砜(DMSO)(aladdin，B1328005);多聚甲醛(永华，040829);hoechst33342染料(solarbio，B8040)。

光学显微镜(OLYMPUS，8A12661);自动酶标分析仪(ETL，182473);流式细胞仪(ETL，E2901);荧光显微镜(OLYMPUS，3H06225)。

2 实验方法

2.1 含药血清制备

健康新西兰兔随机分为含药血清组和对照血清组。含药血清组以人等效剂量的8 倍量中药灌胃，给药剂量为57.12 g/kg·d，每天分2 次给药，连续给药3 d，第3 d 灌胃1 次，给足1 天剂量。末次灌胃前禁食12 h，给药后1 h 在家兔清醒状态下(局麻)从颈动脉采血，常规分离血清，56 ℃水浴30 min灭活补体，用0.22 μm 醋酸纤维素膜过滤除菌，-20℃保存备用。对照血清组以生理盐水灌胃，同法采血制备血清。

2.2 细胞培养

肺腺癌细胞A549 用含10% 胎牛血清的RPMI1640 培养液，置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养，取对数生长期的细胞，调整浓度为1 ×105个/mL，分别用各种浓度的含药血清及芹菜素处理细胞，未加药组(只加单培)为空白对照组。RPMI1640 培养液稀释含药血清，含药血清浓度梯度为10%、5%、2.5%、0%(空白血清组)，空白血清补齐，使终末血清浓度均为10%。芹菜素溶解于DMSO 5‰，初浓度为10 mmoL/L，用RPMI1640 培养液稀释成50 μmoL/L，倍比稀释法稀释，并保证每组DMSO 浓度为5‰。

2.3 分组方法

加味苇茎汤含药血清分组设置:10%含药血清组、5%含药血清组、2.5%含药血清组、空白血清组、空白对照组(单培组)。

芹菜素实验分组设置:50、25、12.5、6.25 μmoL/L 芹菜素样品组、空白对照组(单培组)、DMSO5‰组。

2.4 指标检测

2.4.1 细胞形态学变化

每孔100 μL 单细胞悬液接种于96 孔板上，培养过夜，于倒置显微镜下观察不同浓度含药血清及芹菜素作用后24、48 h 时细胞形态变化。

2.4.2 细胞生长抑制率

每孔100 μL 单细胞悬液接种于96 孔板上，细胞贴壁后分组给药，每组8 个复孔，按上述培养方法分别培养24、48 h。并于24、48 h 提前4 h 每孔加入MTT 20 μL(10 mg/mL)，继续培养至4 h 后弃培养液终止培养，每孔加入150 μL DMSO 溶解液，低速振荡15 min，空白孔调零，使用酶标仪在490 nm 波长处检测OD 值，计算细胞生长抑制率。

细胞生长抑制率=(1-实验组OD 值/空白对照组OD 值) ×100%

2.4.3 细胞周期

每孔1500 μL 单细胞悬液接种于6 孔培养板中，细胞贴壁后分组给药，每组3 个复孔，按上述培养方法分别培养24、48 h。消化收集细胞，调整浓度为5 ×105个，加入BindingBuffer 悬浮细胞500 μL后，加入PI 2 μL 混匀，避光、室温反应20 min，流式细胞仪检测。

2.4.4 细胞凋亡

每孔1500 μL 单细胞悬液接种于铺有处理过的盖玻片的6 孔培养板中，细胞贴壁后分组给药，每组3 个复孔，按上述培养方法分别培养24、48 h。PBS洗涤细胞，多聚甲醛4 ℃固定20 min，hoechst33342 37 ℃染色10 min，PBS 洗片后，荧光显微镜下观察和拍摄细胞凋亡状况。

2.5 统计学方法

实验数据以统计学软件SPSS15.0 计算，所有实验数据均以均数±标准差表示，各组数据均进行正态检验及F 方差齐性检验。方差齐用单因素方差分析，P＜0.05 为差异有显著性意义。

3 实验结果

3.1 加味苇茎汤及芹菜素对A549 细胞形态的影响

结果显示，空白对照组、空白血清组、DMSO 5‰组的细胞贴壁生长，几乎无脱落，胞浆饱满，舒展生长，贴壁牢固，相邻细胞生长融合成片;含药血清组及芹菜素组24、48 h 后出现不同程度细胞间连接不牢固，细胞逐渐脱落。脱落细胞悬浮于培养液中，细胞形态变圆，胞膜完整，颗粒感、体积缩小，核固缩出现，核颜色加深，折光性增强。以50 μmoL/L 的芹菜素组作用48 h 最为明显。

3.2 加味苇茎汤及芹菜素对A549 细胞生长抑制率的影响

结果显示，10%、5%、2.5%含药血清作用于肺癌A549 细胞24 h 后，抑制率分别为31%、13%、10%;作用48 h 后，抑制率分别为45%、24%、8%，与空白对照组比较，差异均有非常显著性意义(P＜0.01)。空白血清对该细胞生长无抑制作用。见表1。

芹菜素50、25、12.5、6.25 μmoL/L 作用于肺癌A549 细胞24 h 后，抑制率分别为34%、29%、28%、17%;作用48 h 后，抑制率分别为53%、44%、30%、9%，与空白对照组比较，差异均有非常显著性意义(P＜0.01)。5‰ DMSO 对细胞有一定的毒害作用，但芹菜素组与DMSO 组比较，差异仍具有显著性意义(P＜0.01)，见表2。

结果显示:加味苇茎汤含药血清及芹菜素对肺癌细胞A549 具有抑制作用，且呈一定的量效、时效关系。且作用相同时间后，芹菜素对细胞的抑制作用明显高于含药血清组。

表1 加味苇茎汤含药血清对A549 细胞增殖的影响(±s，n=10，%)Table 1 Effect of Jiawei Weijing decoction (in blood serum)on the proliferation of A549 cells (±s，n=10，%)

表1 加味苇茎汤含药血清对A549 细胞增殖的影响(±s，n=10，%)Table 1 Effect of Jiawei Weijing decoction (in blood serum)on the proliferation of A549 cells (±s，n=10，%)

注:与空白对照组比较 * P ＜0.05，＊＊P ＜0.01。Note:Compared to blank control group，* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01.

表2 芹菜素对A549 细胞增殖的影响(±s，n=10，%)Table 2 Effect of apigenin on the proliferation of A549 cells (±s，n=10，%)

表2 芹菜素对A549 细胞增殖的影响(±s，n=10，%)Table 2 Effect of apigenin on the proliferation of A549 cells (±s，n=10，%)

注:与空白对照组比较 * P ＜0.05，＊＊P ＜0.01。Note:Compared to blank control group，* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01.

3.3 加味苇茎汤及芹菜素对A549 细胞周期及凋亡率的影响

空白对照组DNA 组方图为典型肿瘤细胞的G0/1 峰型。不同浓度含药血清作用于肺癌A549 细胞后，G1 期细胞减少，G2 期细胞明显增多，且时间越长、浓度越高，G2 期阻滞越明显，并见细胞有凋亡。10%含药血清作用细胞48 h 后，G2 期细胞比例由空白对照组的(6.50 ±0.30)增高至(34.80 ±0.74)%，是空白对照组的5.3 倍。空白血清组对细胞周期及凋亡无明显影响，见表3(P＜0.01)。

不同浓度芹菜素作用于细胞后，G1 期细胞减少，G2 期细胞比例增加，但无剂量依赖性;48 h 细胞周期无明显规律性改变，但凋亡率明显增高，可见凋亡细胞形成的亚G1 峰，凋亡率随着质量浓度增加而逐渐升高，并呈一定的时效关系，50 μmoL/L 作用48 h 后，凋亡率达20.74%。溶剂组(5‰DMSO)对细胞周期及凋亡无明显影响，见表4(P＜0.01)。

结果显示:加味苇茎汤含药血清主要通过将A549 细胞阻滞于G2 期、阻止细胞进行有丝分裂来发挥抗肿瘤作用;而芹菜素主要通过诱导A549 细胞凋亡发挥抗肿瘤作用，其诱导细胞凋亡的作用明显强于含药血清组。

表3 加味苇茎汤含药血清对A549 细胞周期及凋亡率的影响(±s，n=3，%)Table 3 Effect of Jiawei Weijing decoction (in blood serum)on the cell cycle and apoptotic rate of A549 cells (±s，n=3，%)

表3 加味苇茎汤含药血清对A549 细胞周期及凋亡率的影响(±s，n=3，%)Table 3 Effect of Jiawei Weijing decoction (in blood serum)on the cell cycle and apoptotic rate of A549 cells (±s，n=3，%)

注:与空白对照组比较 * P ＜0.05，＊＊P ＜0.01。Note:Compared to blank control group，* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01.

表4 芹菜素对A549 细胞周期及凋亡率的影响(±s，n=3，%)Table 4 Effect of apigenin on the cell cycle and apoptotic rate of A549 cells (±s，n=3，%)

表4 芹菜素对A549 细胞周期及凋亡率的影响(±s，n=3，%)Table 4 Effect of apigenin on the cell cycle and apoptotic rate of A549 cells (±s，n=3，%)

注:与空白对照组比较 * P ＜0.05，＊＊P ＜0.01。Note:Compared to blank control group，* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01.

3.4 加味苇茎汤及芹菜素对A549 细胞凋亡的影响

荧光显微镜下结果显示，不同浓度含药血清及芹菜素处理细胞，细胞核在24、48 h 时间段中均有破裂，呈大小不等、形态不规则的碎片或呈梅花状，呈较典型的细胞凋亡形态。其中以芹菜素50 μmoL/L、含药血清10% 48 h 的凋亡细胞最多，且细胞脱落，视野内细胞核数明显减少。单培组、空白血清组细胞核完整且均匀分布，细胞平展，边缘平滑，未见有凋亡形态的细胞核。DMSO5‰组有偶见有少量凋亡细胞存在。

4 讨论

临床实践证明，肺癌初期，正气尚未受损，体内一派邪热炽盛之象，热灼津液，炼液为痰;热邪耗伤脉内阴血，血行涩滞，加之邪热伤络动血，导致瘀热互结，从而出现咳嗽、咳痰、痰中带血、发热、胸胁刺痛、舌质深绛等证候。此时中医治疗以攻为主，治以清热解毒、活血通络、化痰散结［2］。清热活血化痰法不仅可单独用于肺癌实证初期，还可在顾护正气的基础上辨证使用，既能改善临床症状，又具有放化疗增效和减毒作用［3］。因此，清热活血是临床治疗早期肺癌的主要方法，临证常以此为原则组方用药［4］。加味苇茎汤是以《备急千金要方》之苇茎汤加虎杖、半枝莲而成，具有清肺化痰、逐瘀排脓的功效，芹菜素是其主要成分之一。

在肺癌发病机制中，痰瘀既是脏腑功能失调、邪毒蕴肺的病理产物，又是致使正气内虚、邪毒与之胶结成块的致病因素，苇茎汤清肺化痰、逐瘀排脓，具攻邪之力［5］。虎杖利胆退黄，清热解毒，活血化瘀，祛痰止咳;半枝莲清热解毒，化瘀利尿，两味药均是诸多医家临床治疗肺癌的常用药。本研究在苇茎汤基础上伍以虎杖、半枝莲，助苇茎汤清肺热、逐肺淤，加强其抗肺癌作用。且现代药理研究证实，该组方不仅可多种机制发挥抗肿瘤作用，而且富含芹菜素，加强了苇茎汤加味在本研究中的配伍意义。

芹菜素可通过抗氧化、调控肿瘤相关基因、影响肿瘤细胞信号传导、诱导肿瘤细胞周期阻滞、诱导细胞凋亡［6］、抑制肿瘤血管形成及抑制肿瘤侵袭和转移相关蛋白酶的活性［7］，以及放化疗增敏、化学预防等多种途径发挥抗肿瘤作用，与其它黄酮类物质(槲皮素、山奈黄酮)相比，芹菜素具有低毒、无诱变性等特点。

增殖能力增强、周期调节失控、凋亡异常是肿瘤细胞的重要生物学特点。本实验首先采用MTT 法计算生长抑制率检测肿瘤细胞分别经不同浓度加味苇茎汤含药血清及芹菜素处理后的增殖情况;为探究两种药物是否通过诱导凋亡抑制A549 细胞增殖，进行了hoechst33342 荧光染色实验;在此基础上，为明确两种药物作用细胞后的凋亡率，及探究是否会通过周期阻滞抑制A549 细胞增殖，进行了流式细胞仪PI 染色法。实验结果显示:加味苇茎汤含药血清组及芹菜素组均能抑制A549 细胞增殖，并呈现一定的量效、时效关系;两组药均能诱导肺癌A549 细胞的凋亡，提示加味苇茎汤含药血清、芹菜素抑制肺癌A549 细胞的增殖都能通过诱导细胞凋亡这个途径发挥作用;两组药对A549 细胞周期均产生了影响，与空白对照组比较，周期分布有了明显变化(P＜0.05)。但两组药对A549 细胞作用后，各指标数据差距明显:作用相同时间后，芹菜素50 μmoL/L 组(最高浓度)对细胞的抑制作用明显高于10%含药血清组(最高浓度)(P＜0.01)，说明在本实验浓度梯度设置范围内，芹菜素对A549 细胞的增殖抑制作用优于加味苇茎汤含药血清;荧光显微镜下，芹菜素作用A549 细胞后，脱落细胞数、凋亡小体明显多于含药血清组，且根据流式检测细胞凋亡率，芹菜素组诱导细胞凋亡作用明显优于含药血清组(P＜0.01)，进一步证明了芹菜素使肺癌A549细胞凋亡明显增加，与增殖抑制实验数据相符，提示芹菜素主要是通过诱导凋亡方式抑制A549 细胞的生长;周期阻滞方面，加味苇茎汤含药血清主要通过将A549 细胞阻滞于G2 期，阻止细胞进行有丝分裂来发挥抗肿瘤作用;芹菜素对细胞也有G2 期阻滞作用，但未呈现量效时效关系。

综上所述，加味苇茎汤含药血清及芹菜素引起的肿瘤生物学变化包括生长抑制、细胞周期阻滞及细胞凋亡，且不同生物学变化与药物浓度与作用时间关系密切，加味苇茎汤含药血清主要是通过将A549 细胞阻滞于G2 期抑制肿瘤细胞增殖，而芹菜素主要指通过诱导细胞凋亡发挥抗肿瘤作用，其具体抗癌机制还有待进一步实验研究。中药单体的研究在明确其生化作用的基础上，丰富中药复方的现代药理研究，促进具有“稳中求胜”特性的中医药国际化。中药复方作为中医药临床最传统最主流的方法，对其研究更有临床指导意义。

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