复合酶法提取龙眼核总黄酮的工艺研究Δ

彭晓青 ，程轩轩，张旭红，潘育方，关恺珍(．广州市第一人民医院，广州 5080;．广东药学院，广州50006)

龙眼(dimocarpus longanLour．)别名龙目、比目、荔枝奴、亚荔枝等，为无患子科(sapindaceae)龙眼属(dimocarpus)植物［1］。龙眼是中国重要的亚热带水果，已有2 000 余年的栽培历史，栽培面积及产量居世界首位［2］。龙眼肉为《中华人民共和国药典:一部》(2010 年版)收载品种，作为保健食品已有千年的历史，味甘性温，具有补益心脾、养血安神之功效。现代药理表明，龙眼提取物能抑制结肠癌细胞生长、诱导癌细胞凋亡、清除自由基、抗疲劳、降血脂、降血糖等作用［3-4］。龙眼核系龙眼的种仁，占果实鲜重的17%(干品约75%)，全国每年废弃的龙眼核高达几十万吨，造成资源的巨大浪费［5］。龙眼核味苦、涩，性平，具有行气散结、止血、燥湿的功效，主治疝气、瘰疬、创伤出血、腋臭、湿疮等［6］。已经证实龙眼核中含有丰富的黄酮类化合物［7］，具有广泛的开发利用价值。

目前龙眼核总黄酮的提取方法多为超声波和热回流，提取条件较为剧烈。鉴于某些酶可以在常温、常压和温和酸碱条件下，使得细胞壁疏松、破裂，加速有效成分溶出，从而提高提取效率，本文以龙眼核为原材料，采用响应面法优化龙眼核总黄酮的复合酶法提取工艺条件，为其开发应用和深入研究提供参考。

1 材料

1.1 仪器

DFT200A 手提式小型高速粉碎机(湖北振华医疗器械有限公司生产)，UV-1800 紫外可见分光光度计(上海美普达仪器有限公司生产)，FA2204 电子天平(杭州汇尔仪器设备有限公司生产)，HH-2 恒温数显水浴锅(澳华仪器有限公司生产)，RE-52AA 旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂生产)。

1.2 药品与试剂

龙眼核(购自广东高州，经广东药学院潘育方教授鉴定为鸡眼龙眼的种子);芦丁标准品(纯度≥98%，中山优诺生物科技发展有限公司生产，批号:11040302);纤维素酶(30 000 U/g，上海蓝季科技发展有限公司生产);果胶酶(20 000 U/g，上海蓝季科技发展有限公司生产);无水乙醇、氢氧化钠、亚硝酸钠、硝酸铝、石油醚等均为分析纯。实验用水为蒸馏水。

2 方法与结果

2.1 标准曲线的绘制

精密称取芦丁对照品12．5 mg，置于25 mL 容量瓶中，用70%乙醇溶解并定容，得芦丁对照品储备液。准确吸取2．0、3．0、4．0、5．0、6．0 ml 芦丁储备液，置于10 ml 容量瓶中，用70%乙醇稀释成0．10、0．15、0．20、0．25、0．30 mg/ml。各取1 ml置于具塞试管中，加70%乙醇1 ml，摇匀后，加入5%的NaNO2溶液0．3 ml;6 min 后 加 入10% 的Al(NO3)3溶 液0．3 ml;6 min 后 再 加 入4% NaOH 溶 液2 ml，摇 匀，静 置10 min。用紫外可见分光光度计在502 nm 处测定吸光度。以吸光度Y为纵坐标，芦丁浓度X(mg/ml)为横坐标，绘制标准曲线，得到回归方程为:Y=11．865 0X-0．021 2(R2=0．999 9)。芦丁标准溶液质量浓度在21．7～65．2 μg/ml 范围内线性关系良好。

2.2 龙眼核的预处理

将龙眼核药材粉碎过40 目筛，以石油醚(30～60 ℃)为溶剂，料液比为1∶10，于50 ℃水浴回流提取2 次，每次4 h，脱脂，抽滤，滤渣于45 ℃恒温烘干，得到脱脂药材。

2.3 供试品溶液的制备

准确称取脱脂后的龙眼核粉末1 g，置于具塞锥形瓶中，以60%乙醇为提取溶剂，在适宜的料液比、复合酶、pH 值、温度等条件下于水浴锅中酶解，酶解结束后于沸水浴中灭酶2 min，过滤，定容至50 ml 容量瓶中。

2.4 样品测定

准确吸取2 ml 龙眼核提取液，置于10 ml 容量瓶中，用60%乙醇定容至刻度。再吸取2 ml 置于具塞试管中，依次加入5%的NaNO2溶液0．3 ml，摇匀后放置6 min;加入10%的Al(NO3)3溶液0．3 ml，摇匀后放置6 min;加入4%NaOH 溶液2 ml，最后摇匀后静置10 min。于502 nm 处测定吸光度。根据标准曲线方程计算龙眼核总黄酮含量。

2.5 单因素试验

2．5．1 酶种类对龙眼核总黄酮得率的影响:精密称取脱脂后的龙眼核粉末6 份，每份1 g，置于具塞锥形瓶中，其中5 份样品中分别加入0．6%的纤维素酶、果胶酶、复合酶1(纤维素酶∶果胶酶=2∶1)、复合酶2(纤维素酶∶果胶酶=1∶1)和复合酶3(纤维素酶∶果胶酶=1∶2)。按料液比1∶20 加入60%乙醇，盐酸调pH 值至4．5，在50 ℃水浴中酶解2 h，沸水灭酶2 min，趁热过滤，用60%乙醇定容至50 ml。移取提取液2 ml，其余操作同“2．4”项下方法，显色、测定吸光度，结果见图1。结果显示，在同等工艺条件下加入酶可以提高总黄酮的得率，比较不同酶的作用效果，确定复合酶3(纤维素酶∶果胶酶=1∶2)为本次试验用酶。

2．5．2 乙醇浓度对龙眼核总黄酮得率的影响:精密称取脱脂后的龙眼核粉末6 份，每份1 g，置于具塞锥形瓶中，分别按1∶20 的料液比加入30%、40%、50%、60%、70%、80%乙醇，在复合酶用量0．6%、pH=4．5、50 ℃水浴条件下酶解2 h，其余操作同“2．5．1”项下方法，结果见图2。结果显示，选择60%乙醇为最佳提取溶剂。

图1 不同酶对总黄酮提取率的影响Fig 1 Effects of different enzymes on total flavonoids yield

2．5．3 料液比对龙眼核总黄酮得率的影响:精密称取脱脂后的龙眼核粉末6 份，每份1 g，置于具塞锥形瓶中，分别按1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60 的料液比加入60%乙醇，在复合酶用量0．6%、pH=4．5、50 ℃水浴条件下酶解2 h，其余操作同“2．5．1”项下方法，结果见图3。结果显示，料液比由1∶10增至1∶30 过程中，黄酮得率明显增加，此后再增大料液比，黄酮得率趋于平缓或呈下降趋势，故选择1∶30 为适宜料液比。

图3 料液比对总黄酮提取率的影响Fig 3 Effect of solid/liquid ratio on total flavonoids yield

2．5．4 pH 值对龙眼核总黄酮得率的影响:精密称取脱脂后的龙眼核粉末6 份，每份1 g，置于具塞锥形瓶中，复合酶用量0．6%，加入60%乙醇30 ml，分别用盐酸调pH 值至4．0、4．5、5．0、5．5、6．0、6．5，于50 ℃水浴条件下酶解2 h，其余操作同“2．5．1”项下方法，结果见图4。结果显示，最佳pH 值为6．0。2．5．5 酶解温度对龙眼核总黄酮得率的影响:精密称取脱脂后的龙眼核粉末6 份，每份1 g，置于具塞锥形瓶中，加入60%乙醇30 ml，在复合酶用量0．6%、pH=6．0 条件下，分别于40、45、50、55、60、65、70 ℃水浴条件下酶解2 h，其余操作同“2．5．1”项下方法，结果见图5。结果显示，温度达到55 ℃后，总黄酮含量趋于平缓，结合酶的活性温度范围，最终确定55 ℃为最佳酶解温度。

图4 pH 值对总黄酮提取率的影响Fig 4 Effect of pH value on total flavonoids yield

图5 酶解温度对总黄酮提取率的影响Fig 5 Effect of enzymolysis temperature on total flavonoids yield

2．5．6 酶解时间对龙眼核总黄酮得率的影响:精密称取脱脂后的龙眼核粉末6 份，每份1 g，置于具塞锥形瓶中，加入60%乙醇30 ml，在复合酶用量0．6%、pH =6．0、55 ℃水浴条件下分别酶解0．5、1．0、1．5、2．0、2．5、3．0 h，其余操作同“2．5．1”项下方法，结果见图6。结果显示，最佳酶解时间为2．5 h，总黄酮提取率达到最大值。

图6 酶解时间对总黄酮提取率的影响Fig 6 Effect of enzymolysis time on total flavonoids yield

2．5．7 酶用量对龙眼核总黄酮得率的影响:精密称取脱脂后的龙眼核粉末6 份，每份1 g，置于具塞锥形瓶中，分别按0．2%、0．4%、0．6%、0．8%、1．0%、1．2%加入复合酶，提取溶剂为60% 乙醇30 ml，在pH = 6．0、55 ℃水浴条件下酶解2．5 h，其余操作同“2．5．1”项下方法，结果显示图7。结果显示，酶用量为1．0%时，单位底物上的酶浓度已趋于饱和，黄酮提取率最大，故确定复合酶适宜用量为1．0%。

图7 酶用量对总黄酮提取率的影响Fig 7 Effect of enzyme amount on total flavonoids yield

2.6 响应面法优化提取工艺

根据Design Expert 8．0．5 软件中的Box-Behnken 试验设计原理［3，8］，结合单因素考察结果，选取酶解时间、酶用量及pH值3 个主要影响因素，采用3 因素3 水平的响应面分析方法，因素设计及结果见表1、2(A、B、C 分别为pH 值、酶解时间/h、酶用量/%)。

表1 响应面分析因素及水平Tab 1 Factors and levels in response surface analysis

表2 响应面分析方案及结果Tab 2 Program and results of response surface analysis

采用响应面分析试验结果，建立影响因素和龙眼核总黄酮含量Y之间关系的数学模型:Y=-76．529 1 +18．630 38A+12．840 94B+ 63．082 86C+ 2．228 357AB- 0．869 32AC-10．524 5BC-1．901 41A2-3．116 7B2-13．292C2(式中A、B、C分别为pH 值、酶解时间/h、酶用量/%)，回归模型方差分析见表3。二次方程模型的“Prob ＞F”值=0．000 3 ＜0．01，表明该模型极显著，该试验方法可靠。同时失拟相P=0．236 0 ＞0．05(不显著)，说明模型不存在失拟因素，试验结果与数学模型拟合良好，因此可用该回归方程模拟试验真实点。回归模型的相关系数R2=0．963 6，R2Adj=0．916 8，表明96．36%的数据可用此方程解释。变异系数CV =1．07，说明置信度较高，进一步证实模型的拟合性良好。由“Prob ＞F”值可知，B、AB、A2、C2为二次回归模型的显著性因素(P＜0．05)，C、BC、B2为极显著性因素(P＜0．01)。3 因素对总黄酮提取率的影响排序:酶用量＞酶解时间＞pH 值。其中pH 值和酶解时间、酶解时间和酶用量之间的交互作用显著。此结论也可以通过三维响应面的陡度和等高线的形状及密度得到证实［8］，见图8—10。图8、9 等高线近椭圆形且比较密集，三维曲面陡峭，表明各因素间交互作用明显。图10 等高线近圆形且较稀疏，三维曲面较为平坦，说明pH 和酶用量交互作用不显著。

表3 回归模型方差分析Tab 3 Analysis of variance of regression model

2.7 验证试验

通过软件分析计算出理论最佳提取工艺参数为:60%乙醇为提取溶剂，料液比1∶30，酶解温度55 ℃，pH=6．0，酶解时间为2．18 h，复合酶(纤维素酶∶果胶酶=1∶2)用量为1．12%。在此条件下，重复试验5 次，实际测得龙眼核总黄酮得率为30．40 mg/g，与预测值31．90 mg/g 极为接近。

2.8 精密度试验

精称芦丁对照品适量，用70%乙醇制备0．2 mg/ml 的对照品溶液，取1 ml 于具塞试管中，其余操作同“2．1”项下方法，显色并测定吸光度，连续6 次，计算吸光度均值为0．497，RSD=0．43%，表明试验精密度良好。

2.9 重复性试验

准确称取脱脂后的龙眼核粉末6 份，每份1 g，在筛选出的最佳工艺条件下按照“2．3”和“2．4”项下方法制备溶液、显色、测定吸光度。计算总黄酮含量均值为30．78 mg/g，RSD=1．21%。表明重复性良好。

图8 pH 值和酶解时间对总黄酮含量的响应面及等高线图Fig 8 Response surface and contour map of pH and enzymolysis time vs. total flavonoids yield

图9 酶解时间和酶用量对总黄酮含量的响应面及等高线图Fig 9 Response surface and contour map of pH and enzymolysis time and enzyme amount vs. total flavonoids yield

图10 pH 值和酶用量对总黄酮含量的响应面及等高线图Fig 10 Response surface and contour map of pH and enzyme amount vs. total flavonoids yield

2.10 稳定性试验

准确称取脱脂后的龙眼核粉末1 g，在最佳工艺条件下按照2．3 项下方法制备溶液，分别在室温下于第0、30、60、90、120 min吸取溶液2 ml，再按照“2．4”项下方法稀释、显色、测定吸光度。计算总黄酮含量均值为30．54 mg/g，RSD=1．18%，表明样品在2 h 内稳定性良好。

2.11 加样回收率试验

精密称取已知含量的龙眼核粉末6 份，每份1 g，在最佳工艺条件下按照“2．3”项下方法制备样品溶液，每份精密量取2 ml 样品液置于25 ml 容量瓶中，分别加入芦丁对照品溶液(0．2 mg/ml)250 μl，定容至刻度。再吸取2 ml 置于具塞试管中，其余操作同“2．4”项下，显色并测定吸光度。计算总黄酮含量平均加样回收率为98．21%，RSD=1．02%。

3 讨论

本试验中还分别采用传统的乙醇浸提(料液比1∶30，60%乙醇室温浸提24 h)和超声波法(料液比1∶30，60%乙醇室温超声40 min)提取龙眼核总黄酮，经计算总黄酮得率分别为20．28和25．64 mg/g;而酶法提取的最佳工艺条件下总黄酮得率为30．40 mg/g。因此，采用复合酶法提取龙眼核中黄酮类化合物效率高，且反应条件温和有利于有效成分的保存。本文采用响应面法筛选出了复合酶法提取龙眼核总黄酮的最佳工艺参数，数据可靠，具有良好的重复性，可为工业化生产提供参考。

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