HBV感染对乳头状甲状腺癌临床病理及分子生物学特征影响

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(1 青岛大学医学院附属医院肿瘤科，山东 青岛 266003； 2 青岛市市立医院； 3 北京协和医院)

越来越多的研究表明,甲状腺疾病与乙型肝炎间存在着密切的关系。甲状腺自身免疫性疾病和乙型肝炎均参与以甲状腺为靶器官的细胞和体液免疫反应[1]。有研究在甲状腺组织中检测到乙型肝炎病毒(HBV)的DNA序列[2]。BRAFV600E突变和RET癌基因在乳头状甲状腺癌(PTC)的发生、发展和浸润转移中发挥了重要作用。本文研究HBV是否对BRAFV600E突变和RET蛋白表达产生影响，进而探讨其与PTC的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2010年6月—2012年6月北京协和医院手术切除PTC标本184例，病人男52例，女132例，平均年龄(42±12)岁。感染HBV者66例(A组)，未感染HBV者118例(B组)。所有标本均经术后病理检查确诊。

1.2 检测指标及方法

1.2.1临床特征 统计所有研究对象的性别、确诊年龄、肿瘤大小、是否多发病灶(≥2个病灶)、TNM分期、包膜外浸润情况、桥本病及结节甲状腺病并发情况。

1.2.2BRAFV600E突变检测 取石蜡包埋的肿瘤组织(多发病灶取最大者)，行苏木精-伊红(HE)染色，确定肿瘤区域。提取DNA，按照试剂盒(QIA-amp DNA FFPE Tissue Kit)说明书进行操作。采用实时定量PCR方法进行基因检测。BRAF的第15外显子的引物序列：上游为5′-TCATAATGCT-TGCTCTGATAGGA-3′;下游为5′-GGCCAAAA-ATTTAATCAGTGGA-3′。PCR反应体系25 μL，内含cDNA模板200 ng,0.2 mmol/L的dNTP,引物10 mmol/L,Tris-Hcl(pH 8.3),2.5 mmol/L的MgCl2,1 U的TaqDNA聚合酶及双蒸水。反应条件:95 ℃ 10 min,94 ℃变性30 s,58 ℃退火30 s,72 ℃延长30 s,40个循环后,72 ℃延长10 min。取PCR扩增产物6 μL，在25 g/L琼脂糖凝胶中电泳1 h，在凝胶图像分析仪上观察结果。

1.2.3RET蛋白检测 采用免疫组化方法。所有标本均连续切片, 厚度为4 μm。 RET蛋白表达检测应用RET蛋白试剂盒(Santa Cruz公司产品), DAB 显色试剂盒(购于武汉博士德生物工程公司)显色，操作步骤按试剂盒说明书进行, 用PBS 代替一抗作阴性对照，用已知的阳性组织作为阳性对照。RET结果判定: 400倍显微镜下观察，肿瘤细胞胞浆内出现棕黄色颗粒为阳性染色,根据阳性染色肿瘤细胞数占总肿瘤细胞数的百分比及其染色强度分别评分。百分比评分：阳性细胞百分比<10%为1分,阳性细胞百分比10%～40%为2分，阳性细胞百分比41%～70%为3分，阳性细胞百分比>70%为4分。染色强度评分：肿瘤细胞未见染色为0分,弱染色为1分,中等程度染色为2分,强染色为3分。将百分比评分与染色强度评分相乘,得分0～7分为阴性,8～12分为阳性。

1.3 统计学处理

2 结 果

2.1 两组临床病理特征比较

A组结节性甲状腺肿的检出率高于B组，差异有显著性(χ2=5.33，P<0.05)；两组桥本病的检出率差异无显著性(P>0.05)。两组诊断年龄、肿瘤大小、多发病灶、包膜外浸润、颈部淋巴结浸润、远处转移情况比较，差异无显著性(P>0.05)。见表1。

表1 A组和B组病人临床病理特征的比较(例(χ/%))

2.2 两组BRAFV600E突变率比较

PTC病人184例,检测到BRAFV600E突变107例,突变率58.2%，其中A组突变率为56.1%(37/66),B组为59.3%(70/118),两组比较差异无显著性(P>0.05)。

2.3 两组RET蛋白表达比较

PTC组织RET蛋白阳性染色主要分布在甲状腺癌细胞胞浆,细胞核无染色，阳性表达率为45.7%(84/184)。A组RET蛋白阳性表达率为40.9%(27/66),B组为48.3%(57/118),两组间比较差异无显著性(P>0.05)。

3 讨 论

乙型病毒性肝炎是一种世界范围传染性疾病，据世界卫生组织报道，全球约20亿人曾感染过HBV，其中3.5亿人为慢性感染者，每年约有100万人死于HBV感染所致肝衰竭、肝硬化和原发性肝癌(HCC)。慢性乙型肝炎在我国有着较高的发病率,我国目前的HBsAg阳性人口占总人口的10%～15%，5%～10%发展为慢性感染，甚至演变成肝硬化、肝癌,严重危害着我国国民的健康。甲状腺恶性肿瘤是头颈部常见的恶性肿瘤,是内分泌系统最常见的一类恶性肿瘤。PTC是发病率最高的甲状腺恶性肿瘤,占甲状腺癌的70%～80%,占全身恶性肿瘤的1%～2%[3]。肝脏发生病变会影响下丘脑-垂体-甲状腺轴的调控功能，导致血清中甲状腺激素水平的变化，从而出现甲状腺功能障碍[4]。HBV不仅能引起慢性肝炎、肝硬化及肝细胞癌，还能引起一系列的肝外病变。研究结果显示, 乙型肝炎病人血清甲状腺激素含量异常, 可能与肝炎病毒的泛嗜性和病毒直接侵害甲状腺功能有关[5]。有研究结果显示，HBV与甲状腺自身免疫性疾病有关[1]，甲状腺自身免疫性疾病和结节性甲状腺肿增加患PTC的风险[6]。因此，针对HBV感染对PTC发病的影响的研究越来越引起人们的重视。那么，HBV是否会对BRAFV600E、RET基因产生影响，从而进一步推动PTC的发生、发展，至今尚无定论。

本文对比了HBV感染和非感染PTC病人的临床、病理及分子生物学特点,结果显示，PTC合并HBV感染病人结节性甲状腺肿检出率高于无HBV感染者，差异有显著性。既往研究显示，肝炎病毒具有泛嗜性，并可直接损害甲状腺功能[5]，从而导致人体内甲状腺激素相对不足，致使垂体TSH分泌增多，在增多的TSH长时期的刺激下，甲状腺反复增生，伴有各种退行性变，最终形成结节。因此我们推测，HBV感染引起病人血清甲状腺激素含量减低，导致TSH分泌增多是PTC合并HBV感染病人结节性甲状腺肿高发的原因[7]。HBV急性感染、慢性感染及乙型肝炎肝硬化等情况下的甲状腺激素水平的变化，需要进一步的研究。

本文合并HBV感染的PTC病人桥本病检出率也有增高的趋势，但是差异无统计学意义。桥本病属于自身免疫性疾病，病毒感染是其发病原因之一。桥本病的人群发病率不高，而本研究样本例数较少，需要扩大样本量进一步研究。

丝裂原活化的蛋白激酶(MAPK)通路的激活与PTC的发生和进展有密切关系，而BRAF激酶的突变在Raf激酶中能最有效地激活MAPK通路[8]。XING等[9]的研究显示，PTC组织BRAFV-600E突变率为44%。本文研究结果显示，PTC组织BRAFV600E突变率为58.2%，与其报道相符。RET基因与其他基因能形成多种融合基因(RET/PTC-1,RET/PTC-2,RET/PTC-3等),也能激活MAPK信号通路并可能与癌变有关[10-12]。而RET基因重排在PTC病人中也非常普遍,其发生率可达2.5%～100%[13]。本文的研究结果显示，PTC组织RET蛋白阳性表达率为45.7%，与上述报道相符。本研究没有发现HBV感染与BRAFV600E突变和RET蛋白表达的相关性，但HBV感染与PTC其他相关基因的相关性有待进一步的研究。

总之，本研究结果显示，HBV感染的PTC病人结节性甲状腺肿检出率较非HBV感染者更高；桥本病也有类似的趋势，但是差异无统计学意义。由于甲状腺自身免疫性疾病和结节性甲状腺肿增加患PTC的风险[6]，因此，我们推测HBV感染可能是PTC的潜在危险因素。本研究结果未显示HBV感染与肿瘤大小、多发病灶、包膜外浸润、颈部淋巴结浸润、远处转移、BRAFV600E突变及RET基因表达的相关性，但由于存在地区限制和样本量少，故需要进一步对HBV感染与PTC临床病理及分子生物学特点的相关性进行研究。

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