不同促渗剂对复方积雪草苷凝胶膏剂透皮吸收的影响

胡晓，胡静波，董少华，苏卫，陈鹰 （.广州军区武汉总医院，湖北 武汉40070；2.湖北中医药大学，湖北 武汉40065；.南方医科大学，广东 广州5055）

凝胶膏剂（原称巴布膏剂）是以水溶性高分子聚合物为基质骨架材料的新型外用贴剂，其载药量大，保湿性强，透皮性好，皮肤舒适度高，可反复揭贴，无刺激性，明显优于传统的贴膏剂。复方积雪草苷凝胶膏剂是我院新研制的医院制剂，由积雪草苷、醋酸曲安萘德、维生素E 等组成；其中积雪草苷可抑制成纤维细胞的DNA 合成［1］，从而抑制瘢痕增生；醋酸曲安萘德可促进胶原降解［2］；维生素E 能够滋润和保护皮肤；本实验将几味药联用，并采用新型透皮贴膏剂剂型，不仅可使药物持续地发挥协同作用，凝胶膏剂自身的粘附压力，还可进一步抑制瘢痕的形成。为证实所研制的复方积雪草苷凝胶膏剂的透皮效果，本文采用改良Franz扩散池法，考察了不同促渗剂如月桂氮芯卓酮、丙二醇、薄荷醇对主药积雪草苷和醋酸曲安奈德的体外经皮渗透的影响。

1 材料

1100型高效液相色谱仪（安捷伦公司，美国）；AB204－N 电子分析天平（梅特勒—托利多仪器上海有限公司生产）；YB－P6智能透皮试验仪（天津药典标准仪器厂）；SHY02型实验室中药凝胶膏剂小型成型机（天津大学制造）；TDL－60B 低速台式离心机（上海安亭科学仪器厂）；85－2型恒温磁力搅拌器（上海司乐科学仪器厂）。

积雪草苷（广西昌洲天然药业有限公司，含量：80%，批号110926）；积雪苷霜软膏［规格：0.25g／10g（以积雪草总苷计），上海现代制药股份有限公司，批号110303］；积雪草苷对照品（中国药品生物制品检定所，批号110892－200604）；醋酸曲安奈德（天津天药药业股份有限公司，含量：99.6%，批号110601）；醋酸曲安奈德对照品（中国药品生物制品检定所，批号100125－200404）；醋酸曲安奈德乳膏（规格：5mg／20g，唐山红星药业有限责任公司，批号20110104）；β－环糊精（安徽山河药业有限公司）；聚丙烯酸钠NP－700（国际特品公司）；聚乙烯吡咯烷酮（PVP－K90，国 际 特 品 公 司）；羧 甲 基 纤 维 素 钠（CMC－Na，武汉德合昌食品添加剂有限公司）；维生素E（德国巴斯夫维生素有限公司）；丙二醇（湖南尔康制药有限公司）；月桂氮芯卓酮（天门科捷制药有限公司）；薄荷醇（安徽太岛薄荷药业有限公司）；乙腈（色谱纯）；甲醇（色谱纯）。

昆明种小鼠，雌性，10只，体质量18～20g，武汉大学动物实验中心提供，许可证号SCXK－（鄂）2008－0004。

2 方法与结果

2.1 复方积雪草苷凝胶膏剂的制备

2.1.1 不含促渗剂的复方积雪草苷凝胶膏剂的制备 根据预实验的结果，初步确定凝胶膏剂基质的优化处方为：聚丙烯酸钠∶PVP－K90∶CMC－NA∶高岭土＝5∶2∶1∶2。按处方量称取聚丙烯酸钠、聚山梨酯80、CMC－Na、甘氨羟铝、高岭土、二氧化钛分散于甘油中，加入适量苯氧乙醇，混匀，作为油相备用；另取处方量的积雪草苷、PVP－K90、酒石酸、EDTA－4Na、加适量纯化水，磁力搅拌至澄清透明液体，加入适量苯氧乙醇，混匀，作为水相备用。称取处方量的醋酸曲安萘德，维生素E 于适量乙醇中，混匀后加入至上述油相。油相和水相置于减压真空干燥器中反复抽真空以除去气泡，再将水相缓慢加至油相中，迅速搅匀，上机均匀涂布于无纺布上，同时盖膜，剪裁为7cm×10cm 大小，铝箔袋密封包装，贴标签即得成品。成品中每100g 药膏含积雪草总苷2.5g和醋酸曲安奈德25mg。

2.1.2 含不同促渗剂复方积雪草苷凝胶膏剂的制备 根据上述处方，将不同促渗剂（A 含1%月桂氮芯卓酮，B含1%丙二醇，C 含0.5%薄荷醇，D 含1%月桂氮芯卓酮及1%丙二醇）分别加至油相，按照“2.1.1”方法项下制备含不同促渗剂复方积雪草苷凝胶膏剂。

2.2 主药含量测定HPLC方法学的建立

2.2.1 HPLC测定积雪草苷含量方法的建立

（1）色谱条件［4］：色谱柱为Hypersil BDS C18柱（250mm×4.6mm，5μm）；流动相：乙腈－2mmol·L－1－β－环糊精（24∶76）；检测波长205nm；流速1.0 mL·min－1；进样量20μL；柱温35 ℃。

（2）对照品溶液的制备：取积雪草苷对照品5 mg，精密称定，置5mL 量瓶中，用甲醇溶解定容至刻度，配制成1mg·mL－1的标准储备液。

（3）供试品溶液的制备：将体外透皮试验取出的接受液用0.45μm 微孔滤膜过滤，弃去初滤液，取续滤液，即为供试品溶液。

（4）标准曲线的制备：取积雪草苷储备液适量，分别制成800，400，200，100，50，25，12.5μg·mL－1的7份标准溶液，按上述色谱条件进样，测得峰面积。以对照品浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程为：A＝78.469C＋418.5，r＝0.999 3。结 果 表 明 积 雪 草 苷 在12.5～800 μg·mL－1与峰面积的线性关系良好。

（5）精密度试验：取上述线性关系考察项下的低、中、高3种质量浓度（12.5，100，800μg·mL－1）进行分析，每种浓度的溶液重复进样4次，测定峰面积，计算其日内精密度RSD。结果其日内精密度的RSD 分别为0.37%、0.42%、0.63%，表明精密度良好。

（6）稳定性试验：取同一供试品溶液，按照上述色谱条件分别于0，1，2，4，8，12，24h进样，测定积雪草苷峰面积，计算其含量RSD 为0.94%（n＝7），结果表明该供试品中积雪草苷在24h内稳定性良好。

（7）重复性试验：取同一样品体外透皮试验的接收液6份，按“2.2.1（3）”项下方法制备供试品溶液，按上述色谱条件进样，测定峰面积，计算其含量RSD 为0.76%（n＝6），表明本方法的重复性良好。

（8）回收率试验：在12h空白皮肤渗透液中加入一定量积雪草苷对照品，制成低中高浓度分别为25，100，400μg·mL－1的系列溶液，按上述色谱条件进样，测定峰面积，计算其平均回收率为98.54%。结果见表1。

表1 积雪草苷回收率试验结果（n＝6）Tab 1 Results of recovery（n＝6）

2.2.2 HPLC测定醋酸曲安奈德含量方法的建立（1）色谱条件［6］：色谱柱为Hypersil BDS C18柱（250mm×4.6mm，5μm）；流动相为甲醇－水（60∶40）；检测波长240nm；流速1.0mL·min－1；进样量20μL；柱温35 ℃。（2）对照品溶液的制备：取醋酸曲安奈德对照品1mg，精密称定，置50mL量瓶中，用甲醇溶解定容至刻度，配制成20μg·mL－1的标准储备液。（3）供试品溶液的制备：将体外透皮试验取出的接受液用0.45μm 微孔滤膜过滤，弃去初滤液，取续滤液，即为供试品溶液。（4）标准曲线的制备：取醋酸曲安奈德储备液适量，分别制成8，4，2，1，0.5，0.25，0.05μg·mL－1的7份标准溶液，按上述色谱条件进样，测得峰面积。以对照品浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，得 回 归 方 程 为：A ＝101.2 C－1.651，r＝0.999 9。结果表明醋酸曲安奈德在0.05～8μg·mL－1与峰面积的线性关系良好。（5）精密度试验：取上述线性关系考察项下的低、中、高3种质量浓度（0.05，1，8μg·mL－1）进行分析，每种浓度的溶液重复进样4次，测定峰面积，计算其日内精密度RSD。结果其日内精密度的RSD分别为0.50%，0.32%，0.79%，表明精密度良好。（6）稳定性试验：取同一供试品溶液，按照上述色谱条件分别于0，1，2，4，8，12，24h进样，测定醋酸曲安奈德峰面积，计算其含量RSD 为0.86%（n＝7），结果表明该供试品中醋酸曲安奈德在24h内稳定性良好。（7）重复性试验：取同一样品体外透皮试验的接收液6份，按“2.2.2（3）”项下方法制备供试品溶液，按上述色谱条件进样，测定峰面积，计算其含量RSD 为0.52%（n＝6），表明本方法的重复性良好。

（8）回收率试验：在12h空白皮肤渗透液中加入一定量醋酸曲安奈德对照品，制成低、中、高浓度分别为0.25，1，4μg·mL－1的系列溶液，按上述色谱条件进样，测定峰面积，计算其平均回收率为99.43%。结果见表2。

表2 醋酸曲安奈德回收率试验结果（n＝6）Tab 2 Results of recovery（n＝6）

2.3 体外透皮试验法筛选透皮吸收促进剂

2.3.1 离体皮肤的制备［3］取18～20g昆明种小鼠，实验前24h先用剪刀剪去腹部绒毛，再用5%的硫化钠褪毛，然后将小鼠颈椎脱臼处死，取下无破损的腹部皮肤置干净的玻璃板上，用刀片小心剔除皮下脂肪组织及黏连物，生理盐水反复冲洗干净，修剪成合适大小，－20 ℃冰箱保存备用。实验时取出，室温下自然解冻，每次实验前应目视检查皮肤的完整性。

2.3.2 体外透皮试验方法 Franz扩散池的接受池体积为16 mL，扩散面积为1cm2。实验时从冰箱中取出鼠皮，室温下自然解冻，以生理盐水洗净，用滤纸吸干表面水分，凝胶膏剂剪成相应大小紧密贴于鼠皮的角质层，离体皮肤的真皮层面向接受室，排尽皮肤下的空气。接收液为生理盐水。水浴恒温至37 ℃，磁力搅拌转速为400r·min－1。预平衡30 min后开始实验，于0.5，1，2，4，8，12，24h从样品接受室中取出1mL，同时补加等量同温的接收液至接受室，将取出的接收液样品经0.45μm 微孔滤膜过滤，供HPLC进样分析，测定药物浓度，计算单位面积累积渗透量。

2.3.3 药物皮内滞留量的测定 透皮实验结束后，取下离体皮肤置小烧杯中，眼科剪剪碎皮肤组织，移至玻璃匀浆器中捣碎，加入适量甲醇萃取3次，合并萃取液置EP管，氮气挥干，1mL 甲醇溶解残留物，以12 000r·min－1的转速离心5 min，取上清液进样。计算药物皮内滞留量Qm。

图1 复方积雪草苷凝胶膏剂中积雪草苷体外累计透过量－时间曲线图（n＝3）—◆—含1%月桂氮芯卓酮及1%丙二醇组；—□—含1%月桂氮芯卓酮组；—▲—含0.5%薄荷醇组；——含1%丙二醇组；—●—不含促渗剂组；—■—市售积雪苷霜组Fig 1 The asiaticoside accumulative release curve of compound asiaticoside cataplasm in the percutaneous absorption（n＝3）—◆—1% azone＋1% 1，2－di－hydroxypropane；—□—1% azone；—▲— 0.5% menthol；——1，2－di－hydroxypropane；—●—blank group；—■—asiaticoside cataplasm

图2 复方积雪草苷凝胶膏剂中醋酸曲安奈德体外累计透过量－时间曲线图（n＝3）—◆—市售醋酸曲安奈德组；—■—含1%月桂氮芯卓酮＋1%丙二醇组；—▲—含1%月桂氮芯卓酮组；—●—含1%丙二醇组；——含0.5%薄荷醇组；—□—不含促渗剂组Fig 2 The triamcinolone acetonide acetate accumulative release curve of compound asiaticoside cataplasm in the percutaneous absorption（n＝3）—◆—triamcinolone acetonide acetate；—■—1%azone＋1%1，2－dihydroxypropane；—▲—1% azone；—●—1% 1，2－di－hydroxypropane；——0.5% menthol；—□—blank group

结果分析：与不含促渗剂的凝胶膏剂相比，含有促渗剂的积雪草苷和醋酸曲安奈德的单位面积累积渗透量，渗透速率，皮内滞留量均明显增加。各组促渗剂对积雪草苷的促渗能力大小为1%月桂氮芯卓酮＋1%丙二醇＞1%月桂氮芯卓酮＞0.5%薄荷醇＞1%丙二醇。各组促渗剂对醋酸曲安奈德的促渗能力大小为1%月桂氮芯卓酮＋1%丙二醇＞1%月桂氮芯卓酮＞1%丙二醇＞0.5%薄荷醇。与市售制剂比较，1%月桂氮芯卓酮＋1%丙二醇组对积雪草苷和醋酸曲安奈德的透皮速率，单位面积累积渗透量明显增高。比较各组的积雪草苷皮肤角质层滞留量，结果为1%月桂氮芯卓酮＞1%月桂氮芯卓酮＋1%丙二醇＞0.5%薄荷醇＞1%丙二醇，应用1%月桂氮芯卓酮为促渗剂时，积雪草苷的皮肤角质层滞留量最大。比较各组的醋酸曲安奈德皮肤角质层滞留量，结果为1%月桂氮芯卓酮＋1%丙二醇＞1%月桂氮芯卓酮＞1%丙二醇＞0.5%薄荷醇。即当1%月桂氮芯卓酮与1%丙二醇联合使用时，可促进积雪草苷和醋酸曲安奈德的透皮吸收。因此，1%月桂氮芯卓酮＋1%丙二醇可作为复方积雪草苷凝胶膏剂的促渗剂。

3 讨论

目前，常用的促渗剂有数十种，本文在预实验的结果的基础上，并参考相关报道［5－6］，重点考察了月桂氮芯卓酮、丙二醇及薄荷醇对透皮吸收的影响。在预实验中曾分别考察了不同浓度的月桂氮芯卓酮，丙二醇及薄荷醇对透皮吸收和基质性能的影响。结果发现应用单一促渗剂时，1%月桂氮芯卓酮与2%月桂氮芯卓酮的促渗能力无显著差异，3%月桂氮芯卓酮的促渗能力最强，但3%月桂氮芯卓酮组凝胶膏剂的表面有渗油现象，黏性小，防黏层可直接撕开，影响成品的外观性状。不同浓度丙二醇的促渗作用并不随着其浓度增加而增加，丙二醇的浓度为1%时较好。由于增生性瘢痕皮肤角质细胞脆性高，表面有许多裂纹，角质层的屏障功能减弱［7］，且薄荷醇清凉具有刺激性，因此，薄荷醇的浓度为0.5%较合适。应用二元促渗剂时，1%月桂氮芯卓酮＋1%丙二醇组的促渗能力最强。

表3 积雪草苷经皮渗透动力学参数结果（n＝3）Tab 3 Permeation kinetic parameters of asiaticoside（n＝3）

表4 醋酸曲安奈德经皮渗透动力学参数结果（n＝3）Tab 4 Permeation kinetic parameters of triamcinolone acetonide acetate（n＝3）

考察不同促渗剂对复方积雪草苷凝胶膏剂中两个主要成分积雪草苷和醋酸曲安奈德的影响，结果表明采用1%月桂氮芯卓酮＋1%丙二醇作为促渗剂，可显著提高两药的透皮效果；通过Higuchi方程拟合比较，含促渗剂组与不含促渗剂组凝胶膏剂中积雪草苷符合Higuchi方程释放规律；醋酸曲安奈德符合零级缓释规律，起到24h稳定释放效果。

本实验制备的复方积雪草苷巴布剂为交联型巴布剂，基质中甘氨酸铝的高价金属离子与水溶性聚合物聚丙烯酸钠形成交联网状结构，可以充盈大量水分和药物。药物的透皮吸收分为释放，穿透，吸收三个过程。脂溶性的醋酸曲安奈德易于穿过皮肤类脂分子层，但是从水溶性基质中释放成为其透皮吸收的限速过程，因此，在前8h，凝胶膏剂中醋酸曲安奈德的释放较缓慢。市售醋酸曲安奈德乳膏释药相对较快，而从剂型角度来看，衣物摩擦会造成药物损失，影响药物释放。

皮肤角质层是许多药物透皮吸收的一道生理屏障，尤其是水溶性药物较难透过皮肤［8］，在角质层中的扩散是其主要的限速过程。应用透皮吸收促进剂可降低药物通过皮肤阻力，加速药物穿透皮肤。月桂氮芯卓酮进入角质层后可扩大角质层细胞间隙，提高通过细胞间隙水溶性药物的透过量，同时，可对原有的脂质进行重排，从而增加药物通过角质层的渗透性。丙二醇可增加角质层的水合作用，提高类脂的流动性，促进药物的吸收，但是丙二醇与月桂氮芯卓酮联合应用时促渗效果明显强于丙二醇单用的效果。

本实验曾考察了以生理盐水和磷酸盐缓冲液PBS 7.4为透皮接受液，结果发现采用磷酸缓冲液PBS 7.4时，对药物测定有干扰；而以生理盐水为接收液时，空白接受液不干扰药物的检测，峰形较好。

有关市售的抑制疤痕增生的药物，临床多为激素注射，或中药治疗，往往造成不良反应或疗效不佳；实验选用有确切疗效的药物组合，结合新型透皮贴膏剂的释药特性以及其本身的黏附压力物理治疗，达到持续有效地释放药物，为临床疤痕的治疗提供新制剂和实验基础。

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