尼索地平醇质体的制备及体外经皮渗透研究

聂阳，何盛江，陈伶俐，吴泽鹏，谢黛，汪小根 （.广东食品药品职业学院，广东 广州5050；.广东省中药研究所，广东 广州5050）

尼索地平（nisoldipine）为二氢吡啶类钙离子拮抗剂，可选择性地作用于血管平滑肌，显著提高冠脉血流量和供氧，具有抗绞痛、抗心肌缺血和降血压等作用［1－2］。目前，国内已有尼索地平普通片、胶囊、软胶囊、缓释片和缓释胶囊等剂型应用于临床，2008年美国FDA 批准了尼索地平控释片上市，均为口服消化道给药剂型。但尼索地平口服给药，肝首过效应明显，生物利用度低（≤5%），且有口腔溃疡、腹泻、胃肠道出血等消化道不良反应，严重影响了其临床应用和药效发挥［3－4］。

醇质体（ethosomes）是一种可促进药物透过皮肤屏障渗入组织深部的高含醇脂质体，在促进药物经皮渗透方面优于传统脂质体，已成为经皮给药研究的热点［5－6］。如果将尼索地平制备成醇质体，可以提高药物经皮渗透速率和经皮渗透量，维持较高的血药浓度，以期提高其生物利用度，并减少不良反应。本实验采用正交试验优化尼索地平醇质体的处方工艺，通过体外经皮渗透实验，与其混悬液、醇溶液、脂质体对照研究其渗透特性，为透皮制剂的研制提供依据。

1 材料和仪器

1.1 仪器 RYJ－6A 透皮扩散试验仪（上海黄海药检仪器厂，有效扩散面积（S）2.8 cm2，接受池体积（V）6.5 mL）；BP－211D 型电子天平（德国赛多利斯公司）；Agilent 1100 HPLC（美 国 安 捷 伦 公 司）；JEM－1010 透射电子显微镜（日本电子光学公司）；Nano－ZS90激光散射粒度仪（英国马尔文公司）；FA25均质机（德国弗鲁克公司）；SB－100YTD 超声波清洗机（宁波新芝生物科技有限公司）；SH23－2恒温磁力搅拌器（上海梅颖浦仪器仪表制造有限公司）。

1.2 试剂 尼索地平（山东铂源药业有限公司，批号20120612，含量＞99.1%）；注射级大豆卵磷脂（上海太伟药业有限公司，批号20120201，PC≥92.6%）；胆固醇（国药集团化学试剂有限公司，批号20111006）；其他试剂均为分析纯。

1.3 实验动物 昆明种小鼠，♂，体质量（20±2）g，南方医科大学实验动物中心，许可证号：SCXK（粤）2011－0015。

2 方法

2.1 制备方法

2.1.1 醇质体 采用乙醇注入匀质法制备。按100 mL醇质体液处方量，精密称取尼索地平、大豆卵磷脂、胆固醇溶于无水乙醇，置磁力搅拌器搅拌至溶解完全，并转移至注射器针筒中。另取处方量蒸馏水于锥形瓶，水浴30℃，磁力搅拌900 r·min－1，在密封条件下，将针筒中的液体缓慢滴加到锥形瓶中，待滴加完后继续搅拌10 min，冷却至室温，匀质（10 000 r·min－1）5 min，用0.22μm 微孔滤膜滤过，于4℃密封保存。

2.1.2 脂质体 按前期优化的处方工艺，精密称取卵磷脂0.3 g、胆固醇0.1 g和尼索地平0.04 g溶于少量乙醚中，并转移至注射器针筒中，缓慢滴加到10 mL 蒸 馏 水 中，水 浴30℃，磁 力 搅 拌900 r·min－1，持续搅拌至乙醚挥尽，冷却至室温，匀质（10 000 r·min－1）5 min，用0.22μm 微孔滤膜滤过，于4℃密封保存。

2.1.3 其他样品配制 精密称取尼索地平0.4 g，溶于100 mL5%的羧甲基纤维素钠溶液中，磁力搅拌器900 r·min－1搅拌30 min，得0.4%尼索地平混悬液；精密称取尼索地平0.4 g，溶于100 mL体积分数45%的乙醇水溶液，磁力搅拌器900 r·min－1搅拌30 min，得0.4%尼索地平乙醇溶液。

2.2 正交设计优化醇质体处方 参考文献并经预试验，确定影响尼索地平醇质体包封率的4大因素：磷脂含量（A）、药物与磷脂质量比（即药脂比，B）、胆固醇与磷脂质量比（C）和无水乙醇含量（D）。各因素选3个水平，以包封率为考察指标，按正交设计表L9（34）进行试验，因素水平见表1。

表1 尼索地平醇质体处方正交试验因素水平Tab 1 Factors and levers of orthogonal test of nisoldipine ethosomes prescription

2.3 尼索地平含量测定

2.3.1 色谱条件：Eclipse XDB－C18柱（4.6 mm×250 mm，5μm）；流动相：甲醇－水－三乙胺（80∶20∶0.5），以冰醋酸调至pH5.0；流速：1.0mL·min－1；柱温：40℃；检测波长：237 nm；进样量：20μL。尼索地平与其他杂质峰分离良好，磷脂等辅料均无干扰，专属性良好，方法可行，见图1。

2.3.2 标准曲线绘制 精密称取20.12 mg尼索地平置25 mL量瓶中，以甲醇溶解并定容，得储备液。精密移取储备液1 mL 置50 mL 量瓶中，以适量甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀。分别精密吸取1，2，4，6，8，10 mL 于10 mL 量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀。取上述对照品溶液20μL，注入液相色谱仪测定。以峰面积（A）为纵坐标，以药物质量浓度（C）为横坐标进行线性回归，得方程：A＝1.893×105C＋2.689×102，r＝0.999 7，表 明 在1.61～16.10μg·mL－1范围内尼索地平质量浓度与峰面积呈良好的线性关系。

图1 尼索地平液相色谱图A.空白醇质体；B.尼索地平对照品；C.尼索地平醇质体；1.尼索地平Fig 1 HPLC chromatograms of nisoldipineA.blank ethosomes；B.nisoldipine reference substence；C.nisoldipine ethosomes；1.nisoldipine

2.3.3 精密度实验 取“2.3.2”项下同一浓度的对照品溶液，按“2.3.1”项色谱条件测定，重复进样6次，尼索地平峰面积的RSD 为1.36%，表明仪器精密度良好。

2.3.4 稳定性实验 取“2.3.2”项下同一浓度的对照品溶液分别在0，2，4，6，8，12 h进样，尼索地平峰面积的RSD 为0.58%，表明溶液在12 h 内稳定性良好。

2.3.5 回收率实验 取已知空白醇质体适量置50 mL量瓶中，分别精密加入质量浓度为80.48μg·mL－1尼索地平对照品溶液1，5，10 mL，每个质量浓度各配制3 份。按“2.3.1”项色谱条件测定，结果低、中、高质量浓度（1.61，8.05，16.10μg·mL－1）的平均回收率分别为98.05%，100.12%，100.08%；RSD 分别为0.73%，1.06%，0.99%。

2.4 醇质体包封率测定 参照文献［7－8］，采用离心法测定。精密吸取5.0 mL 醇质体液置离心管中，以12 000 r·min－1离心45 min，吸取上清液加流动相稀释，经0.22μm 滤膜滤过，续滤液采用高效液相色谱法测定，计算游离药物质量（m游）。另吸取5.0 mL 醇质体液以甲醇为醇质体消解液，使变澄清，吸取上清液加流动相稀释，经0.22μm 滤膜滤过，续滤液进液相色谱仪测定，计算样品中尼索地平总质量（m总）。根据公式计算包封率：包封率%＝（m总－m游）／m总×100%。

2.5 样品表观形态和粒径分布 将尼索地平醇质体液稀释适当数倍后，滴于铜网上，以1%磷钨酸负染，透射电镜观察形态并拍照；另取尼索地平醇质体液稀释后，用激光粒度仪测定粒径及分布。

2.6 体外经皮渗透试验

2.6.1 离体鼠皮的制备 小鼠脱颈处死，剃除腹毛，分离完整腹部皮肤，剔除皮下脂肪和血管，用生理盐水漂洗干净，剪成适当的大小，于生理盐水浸泡并冷藏保存备用。

2.6.2 体外透皮实验及皮内滞留量的测定 将小鼠皮肤置Franz扩散池上，接受液为6.5 mL 生理盐水，使液面与皮肤内层紧密接触，恒温水浴（32±0.5）℃，以300 r·min－1磁力搅拌。定量移取各种样品溶液0.5 mL均匀涂布于皮肤角质层上（药物含量均为2 mg），并密封。在规定时间（1，2，3，4，6，8，10，12 h）抽取接受液2 mL，并立即补充同温新鲜接受液2 mL。采用皮肤剪碎法测定皮肤中的药物滞留量［9－10］，于12 h 时 取 下 鼠 皮，用 生 理 盐 水 将 皮 肤表面样品冲洗净，剪碎皮肤，用10 mL 乙醇作提取液，超声（200 W）提取30 min，室温冷却。所取的接受液、皮肤样品提取液经过滤和稀释后，经0.22μm滤膜滤过，续滤液采用高效液相色谱法测定，计算单位面积累积渗透药量Qr、稳态透皮速率Js、增渗比IER和12 h皮肤中药物滞留量Qs。

3 结果

3.1 正交试验设计及结果 据正交试验结果极差分析，可知各因素对包封率的影响主次顺序为B＞A＞D＞C（见表2）。方差分析表明，因素A、B 具有显著性，因素C、D 无显著性影响（见表3）。综合得出最佳处方为A2B2C1D3，即100 mL尼索地平醇质体液中大豆磷脂含量3%，药脂比1∶7.5，胆固醇与磷脂质量比1∶10，无水乙醇含量45%。按优选处方连续制备3批醇质体。

3.2 醇质体的表观形态、粒径和包封率 透射电镜观察醇质体形态，可见醇质体呈圆形或类圆形的囊泡，结构完整，见图2。激光散射仪测定粒径，平均粒径为（123.7±41.5）nm，多分散度为0.196，粒径分布均匀（见图3）。4℃密封保存30 d，醇质体外观为浅黄色半透明液体，无分层、浑浊现象。3批醇质体包封率测定结果分别为（68.67±0.85）%，（66.28±1.67）%，（69.07±1.83）%（n＝3），平均包封率为（68.01±1.45）%。

3.3 体外经皮渗透性 以尼索地平的混悬液、45%乙醇溶液、脂质体作为对照，研究尼索地平醇质体的经皮渗透性质，结果见图4和表4。45%乙醇与脂质体溶液均可提高药物的稳态透皮速率，且以45%乙醇溶液促渗效果略强，两者的增渗比分别为5.33和4.80。而醇质体可显著提高药物的稳态透皮速率，其增渗比为11.66，促渗效果强于脂质体和乙醇溶液，分别是45%乙醇溶液和脂质体的2.19倍和2.43倍。醇质体和45%乙醇液及脂质体的透皮速率Js和12 h累计渗透药量Qr，经t检验，P＜0.05，有显著性差异。

表2 尼索地平醇质体处方正交试验设计及结果Tab2 Experimental design and results of orthogonal test of nisoldipine ethosomes prescription

表3 正交试验的方差分析Tab 3 Analysis of variance of orthogonal test

图2 尼索地平醇质体的透射电镜照片（×60 000）Fig 2 Transmission electron microphotography of nisoldipine ethosomes（×60 000）

图3 尼索地平醇质体的粒径分布图Fig 3 Particle size distribution of nisoldipine ethosomes

图4 醇质体和对照制剂的经皮渗透曲线.±s，n＝3）—◆—混悬液；—■—45%乙醇液；—▲—脂质体；—●—醇质体Fig 4 Cumulative penetration curves of nisoldipine penetratingthrough mice skin from ethosomes and control groups.±s，n＝3）—◆—suspensions；—■—45% ethanol solution；—▲—liposomes；—●—ethosomes

表4 醇质体与对照制剂的经皮渗透参数±s，n＝3）Tab 4 Permeation parameters of nisoldipine from ethosomes and control groups through rat shin±s，n＝3）

注：Js 为 稳 态 透 皮 速 率，IER为 各 组Js 与 混 悬 液 组Js 的 比 值，Qr 和Qs 分别为12 h时药物经皮渗透累计量和药物在皮肤中的滞留量

组别 Js／μg·（cm2·h）－1 IER Qr Qs／μg·cm－2／μg·cm－2 45 45% 乙醇液 6.13±0.68 5.33 73.56±8.16 183.99±20.11脂质体 5.52±0.49 4.80 66.24±5.88 151.68±12.39醇质体 13.41±1.12 11.66 160.92±13.44 288.51±27.混悬液 1.15±0.14 1 13.80±1.68 32.94±3.92

3.4 药物在皮肤中滞留量 由12 h皮肤中药物滞留量的结果可知，45%乙醇溶液、脂质体、醇质体均可明显提高皮肤中药物滞留量，其顺序为：醇质体＞45%乙醇溶液＞脂质体＞混悬液（表4）。醇质体在皮肤中的滞留量均高于对照组，分别是45%乙醇溶液、脂 质 体 的1.57倍、1.90倍，经t 检 验，P ＜0.05，差异有显著性。

4 讨论

经皮给药是药物经过皮肤吸收的一种给药方法，具有可避免肝脏首过效应和胃肠道的不良反应，延长有效作用时间，患者可自主用药等优点。皮肤是人体的天然屏障，其表面的角质层也是透皮给药的限速屏障，虽然有大分子通过被动扩散而透过角质层的报道，但一般认为经透皮给药的理想药物：分子量＜400，熔点＜200℃，溶解度低；另外，一个可行的透皮给药药物的剂量应小于20 mg·d－1［11－12］。目前，美国FDA 批准上市的硝酸甘油贴片、尼古丁贴片、可乐定控释贴、睾酮凝胶剂等经皮给药制剂均符合上述条件。尼索地平分子量为388，熔点为148～152℃，在丙酮或三氯甲烷中易溶，在乙醇中略溶，在水中几乎不溶［13］。市售的尼索地平缓释片10 mg／片，每日1片。因此，尼索地平适宜开发为透皮给药制剂。

在筛选制备方法时发现，采用乙醇注入法将尼索地平和大豆卵磷脂溶于乙醇，再注入水中，可获得较高的包封率。为获得大小合适、粒度均匀的醇质体，对制得的醇质体初液尝试用探头超声、高速匀质做进一步处理，再依次挤压通过0.45μm 和0.22 μm 微孔滤膜，最后得醇质体液。结果发现，经处理后的醇质体液较醇质体初液，更易通过微孔滤膜，且醇质体粒径更小；经处理后的两种醇质体液比较，经高速匀质处理的醇质体粒径分布更均匀、制备重复性更好。因此，确定尼索地平醇质体的制备方法为乙醇注入－匀质法。

醇质体因含有高浓度的乙醇而显现出较高的流动性，易于变形穿透皮肤屏障，具有高包封率、高稳定性和优良渗透性等优点，但乙醇浓度过高反而会影响其各项性能。研究发现，随着乙醇浓度的升高，药物透皮速率呈现先增大后减小的趋势，有认为乙醇浓度66%时透皮速率达到最大值［14］，也有认为乙醇浓度60%时体外经皮渗透量明显降低［10］。药物以醇质体为载体的透皮速率，不仅与醇质体中乙醇浓度有关，还与药物本身性质有关，如药物的脂溶性、分子量、pH 等理化性质。López等［15］认为醇质体中乙醇用量不能超过处方量的50%，否则乙醇将溶解处方中的磷脂，使醇脂质体囊泡膜变得易漏，反而使包封率降低。为此，在处方优化试验时，处方中加入了少量的胆固醇以增大脂质层硬度，在保持醇质体含高浓度乙醇的同时，又兼顾了醇质体的包封率和稳定性。按优化处方制备尼索地平醇质体3批，外观结构良好，粒径分布均匀，包封率较高，说明制备方法合理，工艺稳定可行。

体外透皮实验采用小鼠腹部皮肤为离体皮肤，比较尼索地平醇脂质体与其水溶液（混悬液）、同浓度乙醇液（45%乙醇溶液）、普通脂质体的经皮渗透性。实验结果可知，醇质体可明显促进药物经皮渗透，12 h稳态透皮速率和皮肤中药物滞留量均远高于对照制剂。将尼索地平包封于醇质体，能增强其经皮渗透性，有利于药物吸收进入体循环从而发挥全身治疗作用，开辟尼索地平经皮给药防治心绞痛、高血压的新思路，可开发为其非口服给药制剂。

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