高效液相色谱法测定紫色疣石磺中的胆甾醇

孙变娜 沈和定 吴洪喜 姚理想 程知庆 王冬凤

(1.上海海洋大学省部共建水产种质资源发掘与利用教育部重点实验室 上海 201306;2.浙江省海洋水产养殖研究所 浙江温州 325005;3.浙江省近岸水域生物资源开发与保护重点试验室 浙江温州 325005)

紫色疣石磺Peronia verruculata隶属软体动物门(Mollusca),腹足纲(Gastropoda),肺螺亚纲(有肺类Pulmonata),缩眼目(Systellommatophora),石磺科(Onchidiidae);其身体柔软无贝壳,躯体背后部有树枝状鳃[1]。紫色疣石磺多见于我国福建、广东、海南、香港等地沿海潮间带的中下部滩涂,越南、泰国等东南亚国家沿海也有分布,资源丰富。石磺产品已在江苏盐城(俗称海癞子)、浙江温州(俗称涂龟)、福建宁德(俗称土鲍)等地形成广泛的市场,民间流传石磺有治哮喘、治疗风湿病、滋补、助消化、消除疲劳、明目等功效。冰糖炖石磺据说对治疗哮喘有特效,并常被作为产后孕妇良好的滋补品;沿海居民食用石磺的历史悠久[2]。在中国海洋药物辞典中有如下记载:石磺别名土海参,四季捕捞,捕后洗净,除去内脏,取肉鲜用;肉入药;有滋补强壮之功效;主治肝硬化、久病体虚等症状[3]。近几年国内石磺产品供不应求,已从越南等国大量进口。国内外对石磺的研究主要集中在系统分类[1,4,5-7]、生物学特性[8-10]、受精机制[11]、繁殖[12-14]、胚胎发育[15-16]、神经系统[17]、线粒体基因组全序列分析[18]、营养价值[19-20]等,目前,紫色疣石磺中胆甾醇的测定尚未见报道。胆甾醇的测定方法主要有吸光光度法、气相色谱法与高效液相色谱法等。随着色谱技术的发展,高效液相色谱法因其样品预处理简单,方法准确度、精确度及灵敏度较高,在测定生物组织中胆甾醇含量的应用中日益广泛[21-23]。本实验拟建立高效液相色谱法(HPLC)测定紫色疣石磺中的胆甾醇含量,能为胆甾醇分析方法的建立提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

动物材料于2012年11月采集自广东湛江,经上海海洋大学沈和定教授鉴定为紫色疣石磺(Peronia verruculata),凭证标本(No.12DZ-1) 超低温(-80℃)保存在上海海洋大学海洋贝类实验室。取紫色疣石磺解剖并去除内脏,用液氮研磨成粉末。胆甾醇标准品:Sigma公司(C8667);甲醇为色谱纯(Fisher公司),其他药品、试剂均为国产分析纯。

日立L-2130高效液相色谱仪,日立L-2130型泵系统,日立L-2450紫外检测器;电热恒温水浴;KQ-50B舒美超声波清洗器;AUY120型电子分析天平。

1.2 实验方法

1.2.1 标准溶液的配制

精密称取胆甾醇对照品约51mg,置于50mL量瓶中,加适量甲醇超声溶解,用甲醇定容至刻度,摇匀,即得1.02mg/mL的对照品溶液。

1.2.2 供试品溶液的制备

准确称取紫色疣石磺粗粉10.0g,置于250mL具塞锥形瓶中,加三氯甲烷:甲醇(2:1)混合液125mL,超声提取3次,每次20min,用快速滤纸过滤,滤纸及残渣用混合液洗涤数次,收集滤液和洗液,置于250mL具塞圆底烧瓶中,加入无水乙醇25mL,500g/L氢氧化钾溶液6mL,在60～65℃水浴皂化45min,皂化时不断振摇;皂化完毕后,稍冷后加入25mL 50g/L氯化钠溶液,混匀后加入37.5mL乙醚萃取3次,将乙醚溶液置于250mL分液漏斗中,加少量水多次洗涤提取液(至洗涤液为中性),提取液用无水硫酸钠脱水,水浴挥干溶剂,用甲醇定容至100mL,混匀,即得供试品溶液。

1.2.3 色谱条件

色谱柱:COSMOSIL 5C18-MS-Ⅱ,(4.6mm×250mm,5μm);流动相:甲醇;流速1.0mL/min;进样量:20μL;柱温:35℃。紫外检测器波长:204nm。

1.3 定量测定

标准曲线:精密吸取胆甾醇对照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL,分别置于2mL容量瓶中,加甲醇定容至刻度,摇匀。采用外标定量。样品中的胆甾醇含量根据标准曲线方程进行计算。

1.4 回收率测定

在同一样品中加入一定量的胆甾醇标准品,制备供试品溶液,进样测定,以考察方法的准确度。

2 结果与分析

2.1 胆甾醇标准曲线绘制

根据不同质量浓度胆甾醇标准溶液的出峰面积,以胆甾醇质量浓度X(mg/mL)为横坐标,峰面积Y为纵坐标,绘制标准曲线图(见图1)。胆甾醇标准品色谱图如图2所示。

由图1可知,胆甾醇在0.102～0.510mg/mL范围内峰面积与浓度的线性回归方程为,Y=44186105X-331118相关系数R2为0.9998,表明胆甾醇在此质量浓度范围内线性关系良好。由图2可知,胆甾醇的保留时间为13min,出峰较快,为快速检测奠定了基础。

2.2 回收率测定

取已知含量的紫色疣石磺粗粉约5g,共5份,精密称定,分别加入不同浓度胆甾醇对照品,“1.2.2”项方法制备供试品溶液,分别测定,利用差减法求出胆甾醇的回收率(见表1)。结果表明,此方法的平均回收率为98.53%,相对标准偏差RSD=1.72%。

2.3 精密度测定

同一样品重复进样6次,所测峰面积平均值为43517511.33±156546.4,RSD为0.36%。结果表明精密度良好。

2.4 样品的测定

取3批样品,按“1.2.2”项方法制备供试品溶液,按上述色谱条件进行含量测定峰面积并计算含量。3批样品中胆甾醇含量见表2。由结果知,高效液相色谱法测得该紫色疣石磺样品中胆甾醇的平均质量浓度为50.37μg/mL,换算到原料中胆甾醇的平均质量浓度为503.7mg/kg。

3 结语

胆甾醇是维持人体正常新陈代谢不可缺少的原料,是抗老防衰、延年益寿的重要物质之一。它不仅是构成细胞膜的重要组成成分,而且是合成胆汁酸,维生素D以及甾体激素的原料。

本实验建立了高效液相色谱法快速测定紫色疣石磺中胆甾醇含量的检测方法。通过加标回收和精密度实验,表明利用高效液相色谱测定紫色疣石磺中胆甾醇含量在0.102～0.510mg/mL范围内与峰面积值的线性关系良好,相关系数R2为0.9998,回收率范围在96.08%～100.98%,RSD=1.72%,胆甾醇出峰时间为13min,紫色疣石磺样品的胆甾醇质量浓度为503.7mg/kg。曾报道过使用蒸发光散射检测器[23]、电化学检测器[24]的高效液相色谱法测定胆甾醇含量的研究,本实验使用紫外检测器的高效液相色谱法,达到了良好的分离效果。该方法简便、快速,准确,灵敏度和精密度高,分析时间短,能快速检测紫色疣石磺中胆甾醇,可为石磺资源综合利用与开发提供理论依据。

表1 回收率测定结果

表2 紫色疣石磺中胆甾醇含量

图1 胆甾醇标准曲线

图2 胆甾醇标准溶液色谱图

紫色疣石磺 Peronia verruculata

[1]沈和定.中国大陆沿海石磺生物学实验研究及系统分类[D].上海:上海海洋大学,2009:112.

[2]孙变娜,沈和定,吴洪喜,等.石磺营养价值、活性物质的研究现状及开发前景[J].江苏农业科学,2013,41(8):14-17.

[3]姜凤梧,张玉顺.主编.中国海洋药物辞典[M].北京:海洋出版社,1994:81.

[4]SUN B N, CHEN C, SHEN H D, et al. Species diversity of Onchidiidae (Eupulmonata: Heterobranchia) on the mainland of China based on molecular data. Molluscan Research,2013,online.http://dx.doi.org/10.1080/13235818.2013.868860.

[5]吴旭峰,沈和定,吴文健,等.我国华东沿海4种石磺形态学比较[J].动物学杂志,2010,45(6):92-100.

[6]DAYRAT B, TILLIER S. Evolutionary relationships of euthyneuran gastropods(Mollusca): a cladistic revaluation of morphological characters[J].Zoological Journal of the Linnean Society. 2002,135(4):403-470.

[7]陈诚,沈和定,吴文健,等.基于28SrDNA部分序列的石磺科系统发育研究[J].生物技术通报,2010,6:172-178.

[8]沈和定,李家乐,张缓溶.石磺的生物学特性及其增养殖的前景分析[J].中国水产,2004(1):60-63.

[9]张媛溶,周昭曼,卢卫平.上海沿海蛤蟆石磺的初步研究[J].中国贝类学会.贝类学论文集第二辑,北京:科学出版社,1986,153.

[10]黄金田,沈伯平,王资生.瘤背石磺的生态习性观察[J].海洋渔业,2004,26(2):103-109.

[11]吴杨平,沈和定,吴永宁.石磺精子利用规律的初步研究[J].热带海洋学报,2009(1):67-73.

[12]吴杨平,沈和定,代欣欣,等.石磺生殖系统的组织学研究[J].中国水产科学,2007,14(7):17-23.

[13]滕炜鸣,吴旭干,唐伯平,等.瘤背石磺滩涂生态繁殖的初步研究[J].海洋渔业,2007,29(3):214-220.

[14]沈和定,陈汉春,陈贤龙,等.石磺繁殖生物学的实验研究[J].水产学报,2006,30(6):753-760.

[15]沈和定,陈贤龙,陈汉春,等.水温对石磺胚胎发育的影响[J].水产学报,2006,29(6):776-782.

[16]沈和定,陈汉春,陈贤龙,等.盐度对石磺胚胎发育的影响[J].上海水产大学学报,2006,15(3):297-302.

[17]TSUKASA G. Role of cyclic nucleotides in the long-lasting histaminergic inhibition in the mollusc,Onchidium neuron [J].Comparative Biochemistry and Physiology Part C: Comparative Pharmacology. 1988, 91(1): 75-78.

[18]ZHU H C, WEI L L, SHEN H D, et al. Complete mitochondrial genome of Paraoncidium reevesii (Gastropoda,Pulmonata,Systellommatophora,Onchidiidae)[J].Mitochondrial DNA,2012,23(5):379-381.

[19]管菊,沈和定,钱静,等.四种石磺营养成分分析及价值评价[J].食品工业科技,2013,34(17):349-353.

[20]黄金田,王爱民.瘤背石磺营养成分分析及品质评价[J].海洋科学,2008,32(11):29-35.

[21]李琼,党志,文震,等.高效液相色谱测定海龙中胆甾醇[J].理化检验·化学分册,2005,41(4):275-276.

[22]王永生,曹玉恒,王哲,等.HPLC测定蛤蟆油中胆甾醇含量的研究[J].中成药,2008,30(9):1403.

[23] Kazuhiro Hojo, Hideki Hakamata, Ayumi Ito, et al.Determination of total cholesterol in serum by high-performance liquid chromatography with electrochemical detection[J].Journal of Chromatography A, 2007,1166(1):135-141.

[24]孙塞龙,赵志萍,谢建龙,等.高效液相色谱法检测蛋黄卵磷脂中胆甾醇的含量[J].精细化工中间体,2003,33(4):52-53.