版纳微型猪近交系胎儿成纤维细胞的分离培养及性别鉴定

信吉阁 肖晶 查星琴 成文敏 卿玉波 潘伟荣 曾养志 魏红江

（1.云南农业大学动物科学技术学院，昆明 650201；2.云南省版纳微型猪近交系重点实验室，昆明 650201）

版纳微型猪主要分布于云南西双版纳傣族自治州境内的拉祜族、哈尼族，布朗族和瑶族等少数民族居住地区，是我国珍贵的地方品种资源。主要特点表现为体型矮小，生长速度缓慢而性成熟早，是培育医学试验动物理想的素材。版纳微型猪近交系是曾养志教授利用云南特有地方猪种资源，采用连续高度近交加严格选择的科学方法，历经了早期世代中存在的严重近交衰退现象，经过30多年的连续高度近交，培育成功的基因高度纯合、遗传背景清楚而又具有遗传多样性的大型哺乳类试验动物近交系，在生物医学研究、异种器官移植、转基因动物研究以及生命科学研究有着广泛的应用前景，并有望逐步发展形成特有的生物技术产业［1-3］。近年来云南农业大学魏红江教授建立了动物转基因和体细胞克隆技术平台，并于2010年1月得到了世界首只版纳微型猪近交系克隆猪，并陆续得到了多头克隆猪和转基因猪，突破了近交系猪克隆技术和转基因技术［4，5］。

胎儿成纤维细胞是克隆技术和转基因技术中最常用的供体细胞［6-8］，体细胞克隆技术在动物育种、制备转基因动物、基因治疗和器官移植等方面具有重大的作用和广阔的应用前景。而确定克隆和转基因试验中使用的供体细胞的性别，对下一步的克隆动物，转基因动物的鉴定、研究和利用有很重要的意义。目前，其中最为常用的就是SRY-PCR法，即通过扩增位于Y染色体上的性别决定区（Sex-Determination Region）的基因片段来判定胚胎或者细胞的性别［9］，具有特异性强、敏感性高、操作简便、快速高效等特点，而成为目前应用较为广泛的方法。本研究采用胶原酶消化法对同胎妊娠35 d的7只版纳微型猪胎儿进行成纤维细胞分离培养，并利用SRY-PCR法鉴定猪胎儿的性别，旨在建立一种快速、准确的版纳微型猪近交系猪胎儿性别鉴定方法，为进一步的转基因、基因敲除研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验动物 剖腹产手术采集发育到约35 d的版纳微型猪近交系猪胎儿，共7头（编号1、2、3、4、5、6、7），放入到含10% FBS的DMEM中，用冰盒中带回实验室细胞间。

1.1.2 试剂 DMEM/F12培养基、青霉素、链霉素、血清购自Gibco公司；胶原酶、配置PBS所用的试剂购自Sigma公司；细胞培养所用的耗材为JET BIOFIL（广州）产品。细胞基因组提取试剂盒购自于天根公司，引物由上海生工公司合成，Taq酶、Marker等分子试剂购自TaKaRa公司；M（公猪）、F（母猪）这2头已知性别猪的基因组DNA由实验室提供。

1.2 方法

1.2.1 胎儿成纤维细胞的分离培养 小心剥离胎儿及胎衣，将胎儿放置在PBS（含100 IU/mL 青霉素，100 μg/mL 链霉素）中，去除头，四肢，内脏等组织，清洗3遍后剪碎整个胎儿组织，加入1 mg/mL 胶原酶消化液10 mL，放入37℃培养箱消化2-4 h，其间吹打几次并观察消化情况；消化完毕后，将其转移到15 mL 的离心管中，1 000 r/min，5 min，收集细胞，弃上清后将细胞用DMEM/F12+10% FBS清洗两次，用含15%的FBS，100 IU/mL 青霉素，100 μg/mL 链霉素的DMEM/F12培养细胞。第2天观察细胞贴壁情况，并换液，细胞形成细胞单层（80%-90%汇合）后进行传代培养。

1.2.2 胎儿成纤维细胞基因组的提取 取6孔板中的一孔细胞，用0.05% Trysin-EDTA消化3 min，离心收集细胞沉淀，按照天根公司基因组提取试剂盒的操作说明提取7个细胞系的DNA，使用紫外分光光度计检测提取到的基因组DNA浓度。

1.2.3 引物设计与SRY-PCR 参照GenBank中猪SRY基因（GenBank登录号：U49860.2）和β-actin基因（GenBank登录号：XM_003124280.2）的基因序列，使用引物设计软件Primer Premier5.0，设计2对PCR扩增引物，引物序列为：SRY-Forward Primer（SRY-F）：5'-GCTCTCATTGTGTGTTCTCGT-3'，SRYReverse Primer（SRY-R）：5'-CTTAGCGACTGTGTATGTGTAG-3'，β-actin-Forward Primer（β-actin-F）：5'-CCACGAAACTACCTTCAACTCC-3'，β-actin-Reverse Primer（β-actin-R）：5'-GTGATCTCCTTCTGCATCCTGT-3'，扩增片段大小分别为309 bp和132 bp。其中β-actin基因作为内参基因，并以已知性别的公猪（M）为阳性对照，母猪（F）为阴性对照，进行多重PCR。

采用20 μL反应体系，Ex Taq 0.5 μL，25 mmol/L dNTP Mix buffer 2 μL，10× Ex Taq Buffer 2 μL，10 pmol/μL引 物SRY-F、SRY-R、β-actin-F、β-actin-R各1 μL，基 因 组DNA模 板1 μL（2.5 ng），ddH2O 10.5 μL。反应采用Touchdown程序，条件为：95℃预变性3 min；95℃变性30 s，65℃退火30 s，72℃延伸30 s，10个循环；95℃变性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸30 s，25个循环；72℃延伸8 min。取5 μL PCP产物进行2%琼脂糖凝胶电泳检测分析。

2 结果

2.1 猪胎儿成纤维细胞的分离培养

经胶原酶分离，镜下观察可见到大量单个细胞悬浮在培养液中。接种培养6 h后观察到大部分细胞贴壁，细胞呈圆形，尚未伸展。12 h后观察，已有许多细胞贴壁，并开始伸展，原来圆形细胞伸出伪足，细胞形状不规则。培养3-5 d后，细胞伸展，呈梭形、多角形等，为典型的成纤维细胞形态，胞质近中央处有椭圆形细胞核，核仁清晰可见。细胞生长旺盛，3-4 d后，细胞已汇合成单层铺满培养瓶底壁，可传代或冻存（图1）。

图1 猪胎儿成纤维细胞

2.2 PCR扩增及性别鉴定结果

共提取了7个版纳微型猪成纤维细胞系细胞的基因组，经过紫外分光光度计的检测，其浓度和纯度均符合扩增要求。图2显示，公猪M（阳性对照）扩增出了2条带，分别为309 bp的Y染色体特异SRY基因片段和132 bp的β-actin基因片段；母猪（阴性对照）只扩增出132 bp的β-actin基因片段；在水（空白对照）中，没有扩增出任何条带。2、3泳道扩增出SRY基因片段和内参基因片段，应为雄性胚胎，1、4、5、6、7泳道只扩增出内参基因，应为雌性胚胎，8泳道为公猪M（阳性对照），9泳道为母猪F（阴性对照），10泳道为单一SRY基因引物扩增公猪基因组DNA，扩增出309 bp SRY基因片段，11、12泳道为单一的内参基因扩增公猪M，母猪F的基因组DNA，扩增出132 bp的β-actin基因片段。

PCR产物送上海生工生物工程股份有限公司测序。测序结果与NCBI上发表的SRY基因序列比对，具有99%同源性，进一步说明了性别鉴定结果的正确性。

图2 胎儿成纤维细胞系PCR性别鉴定结果

3 讨论

本试验中采用胶原酶分离法成功获得了7只猪胎儿的成纤维细胞，为后续的核移植研究、诱导性多功能干细胞研究奠定了基础。试验中用到的胶原酶一般是从溶组织梭状细胞芽孢杆菌提取制备的，主要水解结缔组织中胶原蛋白成分。如消化的组织较硬，内含较多结缔组织或胶原成分时，可采用胶原酶解离细胞法，适用于消化分离纤维性组织、上皮及癌组织，Ca2+、Mg2+和血清对其活性无抑制作用，对细胞损伤小。使用时应选择适宜的浓度、温度和作用时间［10］。多个研究报道采用胶原酶消化法成功分离了猪胎儿成纤维细胞［11，12］。但试验中发现因为胚胎组织细胞种类较多，虽然除去头、尾、四肢、内脏等，但仍然可见到上皮样细胞（呈星型或三角状）、神经细胞、游走型细胞。这些杂细胞会在反复传代过程中被逐渐淘汰掉。随着培养时间的延长，整个细胞群体呈现火焰状和旋涡状成群细胞呈现放射状、漩涡状等形式。

家畜早期胚胎的性别鉴定是家畜胚胎移植的重要内容，对实现动物性别的人为控制具有重要意义。而在转基因动物生产以及基因敲除研究中，人为控制出生后代的性别，可以最大限度地利用其与性别相关的性状，提高科研价值和经济效益。SRY基因是睾丸决定因子的最佳候选基因，普遍存在于哺乳动物Y染色体中，SRY基因的检测可以特异而快速地判定性别。研究者李小平［13］，曹海峰［14］和尹智［11］也采用了类似PCR的方法鉴定了猪胎儿的性别，本试验采用的SRY-PCR方法，完成了7只版纳微型猪胎儿的性别鉴定，避免了利用巢式PCR方法从核移植胚胎中获得细胞对胚胎的损伤，解决了需进行两轮PCR，试验繁琐、时间长的问题。另外PCR反应采用Touchdown程序，优化了扩增环境，避免了普通多重PCR扩增只有一个退火温度，引物之间退火温度不一致，影响扩增效率的问题，降低了试验难度。同时与染色体核型分析法，抗原法，X染色体相关酶法，染色体特异DNA探针法等性别鉴定方法相比，SRY-PCR应用性更强，可在生产实践广泛地推广。

4 结论

采用胶原酶消化成功分离版纳微型猪胎儿进行成纤维细胞，并利用SRY-PCR法鉴定了猪胎儿的性别，建立了一种快速、准确的版纳微型猪近交系猪胎儿性别鉴定的方法，为转基因、基因敲除试验特定性别供体细胞的选择提供可靠的技术依据。

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