利用紫外诱变选育辅酶q10菌种的研究

梁玲玲

(浙江医药股份有限公司新昌制药厂 浙江绍兴 312500)

从自然界获得的野生菌种,无论在数量上还是质量上都无法满足人类对其需要,因此,对产自于自然界具有某种代谢工程的菌种进行分析、筛选已经成为微生物工程必经环节,菌种选育为人们的生产、生活提供了各种各样的产品。紫外线是一种最常用有效的物理诱变因素,其诱变效应主要是由于它引起DNA结构的改变而形成突变型。紫外线诱变,一般采用15W或30W紫外线灯,照射距离为20-30cm,照射时间依菌种而异,一般为1-3min,死亡率控制在50%-80%为宜。被照射处理的细胞,必须呈均匀分散的单细胞悬浮液状态,以利于均匀接触诱变剂,并可减少不纯种的出现。所以利用紫外诱变可以说是选育高产的菌株是一个很有效的方法[1]。

辅酶q10又称泛醌(Ubiquinone,缩写UQ),是一种存在于自然界的脂溶性醌类化合物,其结构与维生素K、维生素E与质体醌相似。在人类身体细胞内参与能量制造及活化,是预防动脉硬化形成最有效的抗氧化成份是一种脂溶性抗氧化剂,是人类生命不可缺少的重要元素之一,能激活人体细胞和细胞能量的营养,具有提高人体免疫力、增强抗氧化、延缓衰老和增强人体活力等功能,医学上广泛用于心血管系统疾病,国内外广泛将其用于营养保健品及食品添加剂。

强大的市场促使很多制药企业生产这个产品,而目前生产辅酶q10主要是通过生物发酵,但是生物发酵有个缺点就是生产成本高,发酵产率低,所以选育高产菌株,是提高辅酶q10产量的主要手段。而本文着就重研究了紫外诱变对于选育辅酶q10高产菌株是否有促进作用。

1 材料与方法

1.1 出发菌种

辅酶q10菌种[2](球型红假单胞菌),超低温冰箱贮藏。

1.2 培养基

斜面培养基[3]:琼脂20g,葡萄糖15g,酵母粉5g,Nacl 4.2g,碳酸钙38g,加水至1000ml。ph调至4.5。

种子培养基:葡萄糖3%,玉米浆干粉0.05%,Nacl2%,碳酸钙3%,酵母粉0.15%,MgSO40.8%,(NH4)SO45%。ph调至7.0。

发酵培养基:MgSO42%,(NH4)SO42%,葡萄糖8%,Nacl0.5%,KH2PO41%,玉米浆干粉10%。ph调至7.0。

1.3 操作方法

表1

将菌种稀释7倍后均匀的涂在斜面培养基上,然后将斜面培养基放在温度35℃,湿度50%的培养箱中,培养8-9天。菌孢子用20%的无菌水洗下,接入装量为110ml的250ml的三角烧瓶中(内含玻璃珠),摇床振荡30min,然后用生理盐水离心洗2次,再稀释8倍,制成悬浮液。

1.4 紫外诱变过程

将稀释过的悬浮液分别放置在直径6cm的培养皿中,接着把培养皿放置在离紫外灯30cm远的搅拌器上,分别振荡照射0s,30s,60s,90s,120s,150s,180s。然后在超净工作台上进行平板涂布,涂布完后在温度为35℃的培养箱中倒置培养72h,培养箱必须处在黑暗环境中,而它的对照组是用没有进行紫外照射的悬浮液制成的平皿,在相同的条件下也培养72h。培养结束后进行菌落计数,并计算致死率。

1.5 培养条件

在进行完菌落计数的平皿中挑选生长快,菌落大的单菌落接入种子培养基中,在温度为31℃,摇床转速为180r/min的条件下培养24h,然后按5%的接种量接入发酵培养基中,在温度34℃,摇床转速为230r/min的条件下再培养72h[4]。培养结束后检测含量。

1.6 检测方法

在波长为660nm的可光分光光度计下测菌浓。

高效液相色谱测辅酶q10含量 色谱波长275nm 进量为20ul

2 结果(表1)

3 结果分析

通过一系列的准备,我们对球型红假单胞菌进行了紫外诱变,通过与对照组进行比较,可以发现紫外照射120s时诱变的效果最好,其中它的辅酶q10含量提高了11%,存活率提高了15%。所以可以分析出菌体经过紫外照射后,有些濒临死亡的菌种通过修复,提高了存活率,也相应提高了突变菌株的出现率,筛选出的菌株大大提高了辅酶q10的含量,有此可以看出紫外诱变选育对挑选高产菌株起了很大的促进作用。

[1]李义勇,张亚雄.基因重组技术在工业微生物菌种选育中应用的研究进展[J].中国酿造,2009(1).

[2]尹鹏,魏宝东.双重抗性筛选辅酶Q_(10)高产菌株[J].食品工业科技,2012(7).

[3]陈瑜.发酵法生产辅酶Q_(10)的含量分析及工艺优化[J].科技通报,2002(4).

[4]党磊,靳明慧,田菁,王玮,王小雪,庞欣.类球红细菌突变株及其应用[J].生命科学仪器,2010(6).