特发性高钙尿肾结石患者肾乳头组织中Runx2、Osterix的表达＊

何 登， 王少刚， 唐锦辉， 贾招辉， 郭丙涛， 黄 雷， 卢宇超

华中科技大学同济医学院附属同济医院 1泌尿外科2儿科，武汉 430030

特发性高钙尿症（idiopathic hypercalciuria，IH）是引起泌尿系结石的一种常见病因，从代谢角度讲主要表现为全身钙质代谢异常，根据代谢影响因素差异分为肠吸收型、肾钙漏型和骨吸收型3类，IH 所形成的肾结石一般多为草酸钙和磷酸钙结石。IH 引起的泌尿系结石（尿石症）的病因研究一直是研究热点，但其具体发病机制目前尚不明确。近年研究认为肾脏Randall钙斑是尿石形成的基础和起始环节，是位于肾乳头下间质的异位钙化，其钙化斑的主要成分为羟基磷灰石，与骨质成分一致［1－2］，而高钙尿、炎症和应激反应等可以引起肾单位微损伤，并可为肾结石形成提供良好附着位点，因此我们考虑高钙尿可能与肾钙斑形成直接相关。有文献报道Runx2、Osterix在正常骨质形成和异位钙化中起重要作用，因而本研究主要通过检测IH 肾结石患者肾乳头组织中Runx2和Osterix的mRNA 和蛋白表达情况，探讨IH 患者肾结石发生是否和成骨形成过程相关。

1 材料与方法

1.1 材料

兔抗人Runx2 和兔抗人Osterix 购自美国ABR 公司，人鼠共用二抗均购自BT（Bioworld Technology）公司；RNA 提取试剂Trizol为美国Invitrogen公司产品，cDNA 第一链合成试剂盒、实时定量PCR 荧光染色反应预混液SYBR Green I premix购自TaKaRa公司。

1.2 标本选择和采集

从2009年5月～2011年10月在华中科技大学同济医学院附属同济医院泌尿外科住院的患者中筛选出特发性高钙尿的肾草酸钙结石患者，排除各种已知可能影响患者血清钙或者尿钙含量的原发病，如甲状腺旁腺亢进、慢性肾疾病等。要求24h尿钙排泄量＞4mg／kg，或男性＞7mmol，女性＞6 mmol［3］。共选择病例8 例，其中6 例男性，2 例女性，年龄26～61岁，平均（42±15）岁。所有8名患者中1例患者采用经皮肾镜碎石术治疗，术中可明显观察到钙斑，找到肾乳头近Randall钙斑，并取该处肾组织若干，该患者术后未出现明显出血等严重并发症；另7例患者有长期结石病史，部分结石脱落嵌顿肾盂出口或输尿管引起肾脏皮质严重萎缩而无功能，需行单纯肾切除者，术后矢状剖开肾脏，取肾乳头近钙斑处肾组织若干作为IH 组。术后作结石成份分析并应用红外光谱分析技术确诊为草酸钙结石。

此外选取同期因肾肿瘤或非结石所致的无功能肾需行肾切除术的患者8例，取材中排除重度肾积水患者和合并有严重感染而存在组织粘连难以辨析肾乳头组织者。选取男性患者5例，女性3例，年龄31～59岁，平均为（39±17）岁。血清钙及尿钙测定均在正常范围。肾切除术后取肾乳头处组织若干作为对照NC组。

1.3 实时荧光定量－聚合酶链反应（Real－time PCR）检测Runx2和Osterix mRNA的表达情况

Runx2 上下游引物序列分别为5′－CAGAC－CAGCAGCACTCCATA－3′和5′－GCGTCAACACCATCATTCTG－3′；Osterix 序列分别为5′－GCTTATCCAGCCCCCTTTAC－3′和5′－GCCTTGTACCAGGAGCCATA－3′；β－actin 为5′－CACGATGGAGGGGCCGGACTCATC－3′和5′－TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT－3′，均由美国Invitrogen 公司合成提供。RNA提取：剪取绿豆大小200mg左右组织块，加入1mL Trizol，匀浆器匀浆。加入200μL 氯仿，轻轻颠倒数次混匀，室温放置5min。离心12 000r／min 15min，转上层水相（约400μL）于新1.5mL EP管中，加入400μL 异丙醇，混匀，室温静置10 min。离心12 000r／min 10min。弃上清，沉淀用预冷的70%无水乙醇洗3次，空气干燥5～10min，溶于20 μL DEPC 水中。分光光度计测定RNA 浓度。RNA 浓度（μg／μL）＝A260×40×稀释倍数／1 000。取总肾组织RNA 5μg转录成cDNA，以cDNA 为模板，应用SYBR Green 染色法通过 Roto－Gene3000定量PCR 仪（澳大利亚Corbett公司生产）进行RT－PCR 检测。反应体系20μL，包含cDNA 2μL，上游引物（10pmol／μL）μL，下游引物（10 pmol／μL）1μL，SYBR mix 10μL，dd H2O 6μL。反应条件：50℃预变性2 min，95℃变性10 min，95℃变性30s和60℃退火30s，并循环40次。实时记录cDNA 的扩增：包括有扩增曲线和熔解曲线，并在仪器默认条件下进行分析。目的基因与内参β－actin 在同一条件下进行反应。使用Roto－Gene3000计算Ct值。

1.4 Western blot法检测Runx2和Osterix蛋白表达水平

①电泳：取适量RIPA 裂解液匀浆组织，测蛋白浓度后，各样品取50μg总蛋白上样电泳，根据蛋白分子量配制不同浓度的PAGE 胶电泳。Runx2 用8%的PAGE 胶电泳，Osterix 用10%的PAGE 胶电泳。根据预染Marker显示，判断目的蛋白得到充分分离后，停止电泳。②转膜（湿转法）：取出凝胶根据Marker切下目的条带，用蒸馏水冲洗，剪与PAGE凝胶相同大小的PVDF 膜和滤纸，PVDF 膜用甲醇浸泡数秒后和滤纸一同浸泡于电转缓冲液中。按照黑色板－纤维垫－滤纸－凝胶－PVDF膜－滤纸－纤维垫－白色板依次放好，夹紧板后放入转膜仪内，黑色板的一面对照黑色负极。③封闭：用含5% 脱脂奶粉的TBST（封闭液）浸泡PVDF 膜，室温摇床封闭2h。④一抗：用封闭液稀释相应的一抗，使PVDF 膜浸泡于一抗孵育液中，4℃孵育过夜。Runx2，1∶500 稀释；Osterix，1∶200 稀释。⑤二抗：TBST 充分洗涤PVDF 膜5～6 次，5 min／次。用封闭液稀释相应的二抗，1∶500稀释，使PVDF膜浸泡于二抗孵育液中，室温摇床孵育2h。⑥显色曝光：TBST 充分洗涤PVDF 膜5～6次，5min／次。每张膜滴加适量的ECL 底物液，孵育数分钟。待荧光带明显后，用滤纸吸去多余的底物液，覆上保鲜膜，X 线胶片压片后依次放入显影液显影、定影液定影。BandScan分析胶片灰度值。以目的条带的灰度值与同等反应条件下GAPDH 灰度值比作为定量测定指标。

1.5 统计学方法

2 结果

2.1 Real－time PCR测定结果

PCR 反应过程无明显引物二聚体形成和非特异性扩增，各实验标本管内平行性均较好。Osterix mRNA 在IH 组内表达量（2－ΔΔCT平均值）是NC 组的1.65 倍，分别为（1.826±0.462）和（1.030±0.072），差异有统计学意义（P ＜0.05）。Runx2 mRNA 在IH 组表达量是NC 组1.38 倍，分别为（1.437±0.115）和（1.037±0.027），差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.2 Western blot测定

Western blot检测显示NC组和IH 组Osterix蛋白质表达量（灰度值）分别为（1.138±0.143）和（1.621±0.164），差异具有统计学意义（P＜0.05）。Runx2蛋白表达量NC组为（1.585±0.389），IH 组为（1.642±0.395），差异无统计学意义（图1）。

图1 Western blot检测肾乳头Osterix和Runx2蛋白表达Fig.1 Western blot analysis of Osterix and Runx2protein expression in renal papillary tissues

3 讨论

尿石症是泌尿系最常见的一类疾病，尽管目前尿石症的外科治疗方面取得了显著进展，其病因研究也是热点，但其确切的发病机制仍不清楚。目前IH 被公认为是尿石症形成的最危险的因素之一，有研究认为尿钙含量增高可以引起肾单位微损伤，并为结石形成提供良好附着点。另外有研究发现肾脏Randall钙斑是尿石形成的基础和起始环节，它是肾乳头下间质异位钙化，其主要成分为羟基磷灰石，与骨质成分一致［1－2］。因此我们推测高钙尿可能与肾钙斑形成直接相关。本研究小组所培育的国内遗传性高钙尿结石（GHS）大鼠动物模型已证实［4］：GHS大鼠肾小管近端小管髓袢对钙重吸收减少，而尿钙排出明显增加，促进肾结石形成。此外国外研究发现，人体血管的异位钙化与软骨内成骨和膜内成骨矿化过程极其相似，是连续的主动调控过程［5－7］。多种正常骨骼形成所必需的成骨细胞转录因子（Runx2、Osterix）在其中发挥重要作用［8］，Runx2和Osterix的转录受上游骨形成蛋白2（BMP2）调控，而BMPs的异位表达能诱导机体异位钙化，下游信号通路转录因子表达可明显增加［9］。IH 肾结石患者形成结石的可能起始点为Randall斑所在肾组织，肾乳头是否同样出现转录因子Runx2 及Osterix表达量异常，或者IH 患者肾结石形成过程中是否出现与骨质矿化类似的形成机制是需要研究的要点。

Ulsamer等［10］研究认为BMP2 诱导Osterix2表达受Osterix启动子近端区域同源性结构域序列调节。总体上，除正常骨质分化发育外，其他组织罕见Runx2与Osterix表达，而机体出现某些病理发生过程，如血管和肌组织异位钙化时两者表达会有所增强。Byers 等［11］在动物体内研究发现上调Runx2／Cbfa1 表达可明显增加异位钙化的发生。国外文献报道［12］小鼠诱导性高表达Runx2，亦可以明显增加肺组织、肌肉组织以及血管平滑肌内异位钙质沉积。同时国外研究发现［13］在慢性肾病（CKD）或糖尿病患者的血管钙化灶可以检测到BMPs下游转录因子Runx2 和Osterix异常表达。在本实验中我们发现，IH 肾结石患者组较NC 组肾乳头Runx2、Osterix在mRNA 水平表达量明显增高，而Runx2在蛋白质水平表达上IH 组和NC 组无明显差异，而Osterix 蛋白表达IH 组高于NC组。

Runx2和Osterix表达受多种因素调控，BMP2为其上游最重要的调控激素之一。BMPs属TGF－β超家族成员，其中BMP2与异位钙化最密切相关。当机体组织处于炎症、代谢紊乱等环境中时，可能通过BMP2－Runx2／Msx2－Osterix信号途径诱导多潜能间充质前体细胞向成骨样细胞分化，可引起异位钙化［9］。

本实验结果显示Runx2 和Osterix mRNA 表达IH 组均高于NC组，另外Osterix蛋白表达在两组之间存在差异，我们考虑IH 肾结石患者肾乳头可能存在类似于骨质矿化的病理发生过程。Runx2在IH 和NC 组在蛋白表达差异不明显可能与信号通路转录效率，转录后降解的速度相关，此外由于蛋白质翻译水平上受激素、生长因子和转录因子的调节，如TGF－β和过氧化物酶体增殖因子激活受体均可以抑制Runx2 表达，此外有研究发现血管内皮VEGF也可调节和抑制Runx2 翻译。翻译后水平调控，如smard泛素化调节因子1（smurf1）引起蛋白降解加速［14］，最终均引起Runx2 的蛋白表达水平变化从而引起相应通路BMP2－Runx2－Osterix中下游Osterix表达变化。

由于骨发生过程有两条通路共同作用，包括BMP2／Smads／Msx2 和 BMP2／Smads／Runx2 途径，而Msx2一直被认为是有BMP2所调控异位钙化形成的关键因子［13］，因此我们考虑Runx2 蛋白表达量下降也可能受Msx2 翻译蛋白过程调节影响。根据实验结果Osterix 蛋白质表达水平在IH组高于NC组，可以从侧面反映特发性高钙尿症患者肾组织可能通过BMP2／Smads／Msx2发挥作用，引起Osterix 蛋白表达上调。同时本实验组在Msx2指标研究中也发现，特发性高钙尿组Msx2表达量在蛋白水平和mRNA 水平均增加，同样动物体内实验亦获得相似结果（数据未予发表）。

通过本实验，我们可初步推测认为特发性高钙尿（IH）肾结石患者肾乳头Runx2 和Osterix mRNA 表达增强和Osterix蛋白表达增强可能为间质的异位钙化特征之一，与骨形成存在相似的生理机制。根据严格的诊断标准，IH 病例标本较难获取，因而本实验难免存在选择偏倚，以后本实验组会加大样本量进一步论证这一过程。

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