球等鞭金藻胞外多糖的体外抗氧化活性和理化性质的初步分析

孙颖颖, 王 辉

(1. 淮海工学院 江苏省海洋生物技术重点实验室, 江苏 连云港 222005; 2. 北京市医疗器械检验所, 北京 101111)

海洋微藻在生长过程中会不断向外分泌黏性物质, 称为胞外产物(Extracellular products, ECP)[1]。胞外多糖(Extracellular polysaccharides, ECPS)是胞外产物的主要组成成分, 在海洋生态系统的微食物链及微生态系统中发挥着重要作用[2]。研究表明, 微藻胞外多糖具有抗肿瘤、抗病毒、抗辐射和免疫调节等生理活性[3-6]。例如, 黄键等[3]指出, 紫球藻(Porphyridium cruentum)胞外多糖在体外具有抗乙肝病毒作用。王大志等[4]指出, 爪哇曲壳藻亚缢变种(Achnanthes javanicavarsubconstricta)、咖啡形双眉藻 (Amphora coffeaeformis)和多枝舟形藻(Navicula ramosissima)胞外多糖具有抗病毒VHSV 和ASFV活性。Sogawa等[5]发现一种浮游硅藻具有抗肿瘤K-562细胞活性。Umemura等[6]发现裸甲藻(Gymnodiniumsp.)多糖具有免疫调节作用。目前, 某些微藻胞外多糖的抗氧化活性也被报道[7-10]。石全见等[7]指出紫球藻胞外多糖具有清除超氧阴离子(O2·¯)和羟基自由基(·OH)的能力, 对它们的半抑制率IC50分别为0.114 g/L和0.619 g/L。朱劲华等[8]指出硒化紫球藻胞外多糖在实验设定的较低浓度范围内具有抗氧化活性。蔷薇藻(Rhodella reticulata)[9]和裂壶藻(Schizochytriumsp.)[10]等2种海洋微藻的胞外多糖能有效清除·OH、O2·¯和过氧化氢(H2O2)等活性氧。

前期研究发现, 球等鞭金藻(Isochrysis galbana)有较高含量的胞外多糖(ECPS), 可达藻细胞干质量的30%[11]。采用离子交换柱层析和凝胶柱层析等分离技术进行了纯化, 制备到一种胞外纯多糖, 记为ECPSⅢ。在此基础上, 本文通过测定胞外纯多糖ECPSⅢ对O2·¯、·OH和H2O2等活性氧的清除以及还原力, 研究了其体外抗氧化活性; 同时, 通过测定ECPSⅢ中的硫酸基和糖醛酸的含量, 初步分析了其理化性质, 以期为球等鞭金藻胞外多糖的开发应用提供理论依据和实验基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

球等鞭金藻胞外纯多糖ECPSⅢ为白色粉末状固体, 由江苏省海洋生物技术重点实验室制备。

1.2 实验方法

1.2.1 球等鞭金藻胞外多糖对超氧阴离子的清除作用

采用邻苯三酚自氧化体系产生超氧阴离子[12]。反应体系为3.0 mL的Tris-HCl缓冲液(50 mmol/L, pH 8.2), 其中含有3 mmol/L邻苯三酚, 以及不同浓度的多糖样品溶液(0.05～1.6 g/L, 分别为0.05、0.1、0.2、0.4、0.8和1.6 g/L, 下同)。在325 nm波长测定反应液吸光度的变化速率。抑制率(%) = (A-B)/A× 100,A为对照组吸光度的变化速率,B为样品组吸光度的变化速率。

1.2.2 球等鞭金藻胞外多糖对羟基自由基的清除作用

在Smirnoff等方法[13]的基础上, 加以改进, 测定对羟基自由基的清除作用。在3 mL 150 mmol/L的磷酸缓冲液(pH 7.4)中含有10 mmol/L FeSO4, 2 mmol/L水杨酸钠, 6 mmol/L H2O2以及不同浓度的多糖样品溶液(0.05～1.6 g/L, 同上)。37℃下反应1 h, 测定510 nm处的吸光度。抑制率(%)= [1 -(Asample-Asampleblank)/Acontrol] × 100,Acontrol为对照组的吸光度值,Asample为样品组的吸光度,Asampleblank为样品空白的吸光度。

1.2.3 球等鞭金藻胞外多糖对H2O2的清除作用

采用分光光度法测定多糖对H2O2的清除作用[14]。多糖样品溶解在3.4 mL 的PBS中(pH 7.4), 再加入0.6 mL40 mmol/L H2O2, 摇匀后, 在室温下反应10 min, 在230 nm处测定吸光度。抑制率(%)= [1 -(Asample-Asampleblank)/Acontrol] × 100,Acontrol为对照组的吸光度,Asample为样品组的吸光度,Asampleblank为样品空白的吸光度。

1.2.4 球等鞭金藻胞外多糖的还原力

[15]方法, 测定多糖还原力。0.5 mL不同浓度的多糖样品溶液, 1.25 mL PBS(pH 6.6, 0.2 mol/L)溶液以及10 g/L K3Fe(CN)6溶液1.25 mL, 50℃下反应20 min。然后, 加入100 g/L TCA1.25 mL, 6 000 r/min离心10 min。2.5 mL上清液与0.25 mL新配制的1 g/LFeCl3混合, 摇匀后, 在700 nm处检测反应体系溶液的吸光度, 溶液的吸光度增加说明样品的还原力增强。

1.2.5 球等鞭金藻胞外多糖的硫酸基测定

采用硫酸比浊法[16]检测, 由标准硫酸盐作参比绘制标准曲线。

1.2.6 球等鞭金藻胞外多糖的糖醛酸测定

采用硫酸-咔唑法[17]测定, 以葡萄糖醛酸作参比绘制标准曲线。

1.3 数据处理

实验数据采用SPSS11.5软件包进行独立样本检验统计分析,P＜ 0.05为显著性差异,P＜ 0.01为极显著性差异。

2 结果和分析

2.1 球等鞭金藻胞外多糖ECPSⅢ对超氧阴离子的清除作用

由图1可以看出, 在浓度0.05～1.6 g/L范围内, ECPSⅢ对超氧阴离子的清除率随多糖浓度升高而显著(P＜ 0.05)增强。当浓度为1.6 g/L时, 抗坏血酸(Vc)和ECPSⅢ对超氧阴离子的清除率分别为52.7%和48.5%。在实验设定浓度范围内, ECPSⅢ对超氧阴离子的清除作用与Vc接近。

图1 球等鞭金藻胞外多糖ECPSⅢ对超氧阴离子的清除作用 Fig. 1 Scavenging activity of extracellular polysaccharide ECPS III from Isochrysis galbana against superoxide radical with ascorbic acid applied as a positive control

2.2 球等鞭金藻胞外多糖ECPSⅢ对羟基自由基的清除作用

图2表明, 随着多糖浓度的升高, ECPSⅢ对羟基自由基的清除作用显著(P＜ 0.05)增强。当浓度为1.6 g/L时, ECPSⅢ对羟基自由基的清除率分别达到63.6%。Vc浓度为0.8 g/L时, 其对羟基自由基的清除率为64.2%, 这表明, ECPSⅢ具有中等清除羟基自由基的能力。

2.3 球等鞭金藻胞外多糖ECPSⅢ对H2O2的清除作用

在图3中, 当多糖浓度从0.05增加至1.6 g/L时, ECPSⅢ对H2O2的清除率从7.76%升至49.8%, 其对H2O2的清除作用随多糖浓度的升高而显著(P＜ 0.05)增强。在实验设定浓度范围内, ECPSⅢ对H2O2的清除作用显著(P＜ 0.05)低于Vc对H2O2的清除作用。

图2 球等鞭金藻胞外多糖ECPSⅢ对羟基自由基的清除作用 Fig.2 Scavenging activity of extracellular polysaccharide ECPS III from Isochrysis galbana against hydroxyl radical with ascorbic acid applied as a positive control

图3 球等鞭金藻胞外多糖ECPSⅢ对过氧化氢的清除作用 Fig.3 Scavenging activity of extracellular polysaccharide ECPS III from Isochrysis galbana against hydrogen peroxide with ascorbic acid applied as a positive control

2.4 球等鞭金藻胞外多糖ECPSⅢ的还原力

随着多糖浓度的升高, ECPSⅢ的还原力显著 (P＜ 0.05)增加。在实验设定浓度范围内, Vc对赤血盐溶液的还原作用显著(P＜ 0.05)高于ECPSⅢ对赤血盐溶液的还原作用(图4)。

2.5 球等鞭金藻胞外多糖ECPSⅢ的硫酸基和糖醛酸含量

硫酸基标准曲线为,y= 5.1419x-0.0306 (R2= 0.9881), 其中,x为硫酸基质量(mg),y为A530。

葡萄糖醛酸的标准曲线为,y= 5.1419x-0.0306 (R2= 0.9818), 其中,x为葡萄糖醛酸质量(mg),y为A360。

通过计算, 得到ECPSⅢ中硫酸基和糖醛酸含量, 分别为76.90 mg/g和17.1%。

图4 球等鞭金藻胞外多糖ECPSⅢ的还原力 Fig. 4 Total reductive potential of extracellular polysaccharide ECPS III from Isochrysis galbana with ascorbic acid applied as a positive control

3 讨论

微藻胞外多糖是微藻在生长代谢过程中分泌到细胞壁外、易与菌体分离的水溶性多糖或多糖复合物, 具有多样性和复杂性等特点, 并且因为其理化性质独特, 生物活性优良而备受关注。球等鞭金藻富含多不饱和脂肪酸, 蛋白质和多糖[18-20], 是水产养殖业中常用的饵料微藻。近年来, 随着微藻多糖研究的深入, 对球等鞭金藻多糖的研究日益增多[18-23]。然而, 相对于其他微藻多糖而言, 球等鞭金藻多糖的研究尚处于起步阶段, 尤其是胞外多糖的研究[11,21]。

通过前期研究, 制备到球等鞭金藻胞外纯多糖ECPSⅢ。在此基础上, 本文通过测定ECPSⅢ对O2·¯、·OH和H2O2等活性氧的清除作用和还原力, 初步分析了ECPSⅢ的体外抗氧化活性。结果表明, ECPSⅢ具有清除O2·¯、·OH 和H2O2的能力, 尤其对O2·¯和·OH的清除作用较强。以Vc作为对照, ECPSⅢ具有中高等强度清除O2·¯和·OH的能力(图1、图2和图3)。ECPSⅢ具有一定的还原力, 但显著低于Vc的还原力(图4)。王凌等将紫球藻胞外多糖进行降解处理, 发现其降解组分的总还原力与Vc相近, 对O2·¯和·OH的清除率可达到94.89%和88.98%[24]。石全见采用降解和衍生化两种修饰方法处理紫球藻胞外多糖, 制备到一种具有较强抗氧化能力的多糖, 对O2·¯和·OH的清除率在70%以上[25]。这些研究表明, 微藻胞外多糖通过某些处理(降解、硫酸酯化和羧甲基化等)可以提高其抗氧化活性。因此, 通过某些处理, 很可能进一步提高ECPSⅢ的抗氧化能力。

同时, 本文还测定了ECPSⅢ中的糖醛酸含量, 为17.1%。梅秋红等[26]指出铜绿微囊藻胞外纯多糖EAPAⅠ的糖醛酸含量为10.74%。林寿[27]认为糖醛酸的存在是酸性多糖具有特殊生理活性的重要原因之一。梅秋红等[26]发现铜绿微囊藻胞内多糖的糖醛酸含量高于其胞外多糖的糖醛酸含量, 为12.75%。他们指出胞内多糖的酸性较胞外多糖更强, 从而可能导致它们的生物学效应有所区别。硫酸基也是微藻多糖具有生物活性和生理功能的主要官能团[28,29]。石全见等[25]发现不同硫酸基含量的多糖抗氧化能力存在明显差异, 随着硫酸基含量增大, 多糖抗氧化能力增强。本研究中, ECPSⅢ中硫酸基含量为76.90 mg/g, 铜绿微囊藻胞外纯多糖EAPAⅠ的硫酸基含量为44.44 mg/g[26], 新月菱形藻和紫球藻胞外多糖的硫酸基含量不超过4%[30-31]。上述结果表明, ECPSⅢ中硫酸基和糖醛酸含量较高。

球等鞭金藻是一种已经实现大规模养殖的海洋微藻, 在培养过程中能产生含量丰富的胞外多糖[21], 并且胞外多糖中酸性多糖的含量显著高于中性多糖的含量。同时, 本文结果表明, 胞外纯多糖具有一定的抗氧化活性, 还富含硫酸基和糖醛酸。这就表明, 球等鞭金藻胞外多糖具有广阔的应用前景。

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