硝基苯和间苯二酚对3种海洋微藻的毒理效应

王洪斌, 花文凤, 李信书, 李士虎, 阎斌伦

(1. 淮海工学院 海洋学院, 江苏 连云港 222005; 2.江苏省海洋生物技术重点实验室, 江苏 连云港 222005)

藻类作为海洋和内陆水体中重要的初级生产者, 在整个生态系统中有着举足轻重的地位。微藻具有很重要的生态价值[1-2], 微藻在海洋生物中约占40.86%, 其比重非常之大。微藻中固定碳的量约占全球有机物中的50%[3]。同时很多天然的产品都来源于微藻[4]。近年来, 化工废水污染越来越严重, 已经威胁到人类的生存环境, 化学物质通过各种途径污染水体, 第一个受害者就是藻类生物。从环境学角度来看, 研究化学物质对藻类的毒理效应至关重要。自从20世纪60年代以来, 国外许多学者在这方面进行了大量的工作, 积累了丰富的资料, 并取得了较为满意的结果。在水环境中, 藻类一旦富集化学物质, 便进入食物链, 经过生物逐级放大, 将危及水生动物和人类的健康。

本文以塔玛亚历山大藻、海链藻和绿色巴夫藻作为供试藻种, 通过2种不同浓度的化学试剂对3种海洋微藻的生长及叶绿素a合成的影响, 研究其对微藻的毒理效应, 旨在提示化学物质污染对水体危害的严重性, 揭示海洋微藻净化废水的可行性。

1 材料与方法

1.1 材料

藻种塔玛亚历山大藻(Alexandrium tamarense)、海链藻(Thalassiosira weissflogii)、绿色巴夫藻(Pavlova viridis)均为淮海工学院海洋学院海藻实验室保存种。海水培养液采用f/2 加富海水, 微藻培养所用海水采自连云港高公岛海域(盐度约31.00～32.00)涨潮时, 醋酸纤维薄膜过滤, 在121℃下20 min灭菌待用。

硝基苯溶液: 取0.025mL硝基苯于100mL烧杯中, 加适量蒸馏水溶解, 转至100mL容量瓶, 定容至100mL, 然后移至250mL锥形瓶备用。

间苯二酚溶液: 称取0.03g间苯二酚于100mL烧杯中, 加适量蒸馏水溶解, 转至100mL容量瓶, 定容至100mL, 然后移至250mL锥形瓶备用。

1.2 方法

1.2.1 微藻培养方法

藻种在 f/2 培养液中培养到指数生长期接种物。微藻不通气静止培养, 采用f/2海水培养液, 在无菌条件下将20 mL处于对数期的藻种接种于装有180 mL f/2培养液的500 mL的锥形瓶中, 光照度为3000 lx, 明暗周期12 h /12 h, 每日定时摇动3次, (23 ±1)℃下培养[5]。

1.2.2 微藻生长测定

取培养至第4d的藻液200 mL, 分别加入0mL、1 mL、2 mL、4 mL、8 mL已配好的硝基苯溶液, 使硝基苯质量浓度分别为0、1.5、3、6、12mg/L 5个梯度, 间苯二酚实验同硝基苯, 采用吸光度法定时对其生长进行测定。每个实验设3个平行组。

吸光度的测定: 以接种时刻为初始时间开始测定, 每天取出5 mL 藻液。以蒸馏水为空白对照, 分别在680 nm波长下测定每种藻A值。连续7d。

比生长速率计算:K= (lnNt－lnN0)/T。其中K为比生长速率,N0为藻液起始浓度,Nt为培养t时间后的藻液浓度,T为培养时间(h)。

1.2.3 微藻叶绿素a含量测定

采用热乙醇萃取分光光度法[6]取10mL培养至20d的共培养藻液, 5℃、6000r/min离心5min, 弃上清液, 取沉淀-20℃下冷冻12h。取出后迅速用9mL 95%乙醇(80℃预热)于80℃热水浴萃取2min, 超声波清洗仪超声振荡处理10min, 于4℃黑暗静置6h后, 5℃、6000r/min离心5min, 取上清, 用分光光度计于波长665nm和750nm分别测定A值, 加入1mol/L盐酸酸化, 于波长665nm和750nm处再分别测定A值, 按下列公式计算叶绿素含量。

式中, Chla乙醉为乙醇法测定的叶绿素a质量浓度(μg/L);E665为乙醇萃取液于波长665nm的吸光值;E750为乙醇萃取液于波长750nm的吸光值;A665为乙醇萃取液酸化后于波长665nm的吸光值;A750为乙醇萃取液酸化后于波长750nm的吸光值;V乙醇为乙醇萃取液的体积(mL);V藻样为藻样的体积(L)。

2 结果与分析

2.1 硝基苯对3种海洋微藻生长量的影响

2.1.1 塔玛亚历山大藻( A. tamarense )

低质量浓度的硝基苯对A. tamarense抑制作用不明显, 随着培养时间的延长,A. tamarense的生长量虽然都在增长, 但硝基苯质量浓度越高,A. tamarense的比生长速率越小。对照组生长最好, 在硝基苯质量浓度为12mg/L时抑制现象最为明显, 与对照组比较, 抑制率达22.3%, 这与杜庆才等[7]和沈洛夫等[8]的研究结论一致。结果见图1。

图1 不同质量浓度硝基苯对A. tamarense生长量的影响 Fig. 1 Effect of different concentration of nitrobenzene on the growth of A. tamarense

2.1.2 海链藻(T. weissflogii)

随着培养时间的增加, 不同质量浓度的硝基苯条件下,T. weissflogii的生长量有一个先降后升的趋势, 这可能是微藻对硝基苯有一个短暂的适应期。整体来看, 硝基苯对T. weissflogii的抑制现象不及另外2种藻明显, 从其生长曲线图(图2)可以看出, 它反而有一定的促进作用, 这与杜庆才等[7]的研究结论不一致, 可能由于海洋微藻得的种属差异对硝基苯 的毒性作用产生差异, 尚有待进一步研究。硝基苯质量浓度的增大对T. weissflogii的比生长速率影响不明显, 由图2可以看出, 对照组及1.5mg/L组在第7天时生长量最低, 其他3组均高于对照组水平。

图2 不同质量浓度硝基苯对T. weissflogii生长量的影响 Fig. 2 Effect of different concentration of nitrobenzene on the growth of T. weissflogii

2.1.3 绿色巴夫藻(P. viridis)

由图3可知, 对照组生长最好, 硝基苯的添加对P. viridis的生长有抑制作用,随着硝基苯质量浓度的增大, 对P. viridis的生长量抑制越明显。硝基苯质量浓度为12mg/L时, 抑制率相对于对照组达到了20.04%, 在其他质量浓度下, 相对于对照组的抑制率都在9%左右。所以, 对于P. viridis, 硝基苯抑制作用呈现剂量效应。

图3 不同质量浓度硝基苯对P. viridis生长量的影响 Fig. 3 Effect of different concentration of nitrobenzene on the growth of P. viridis

2.2 间苯二酚对3种海洋微藻生长量的影响

2.2.1 塔玛亚历山大藻( A. tamarense )

加间苯二酚后,A. tamarense的生长并没有和预计的一样受到明显抑制, 反而是添加一定量的间苯二酚, 其生长更好, 不同质量浓度的间苯二酚对其均有一定的促进作用, 且在间苯二酚质量浓度为3mg/L时,A. tamarense的生长量高于对照组13.26%。此结论与许文武等[9]有差异, 是否说明A. tamarense在生长代谢过程中能利用间苯二酚有待证实, 但揭示了海洋微藻在处理化工废水方面有潜在的应用前景。由图4可知, 在质量浓度为3mg/L时, 第7天生长量达到了最高, 高于对照组13.26%, 间苯二酚质量浓度高于3mg/L时, 它的促进率又有所下降。

2.2.2 海链藻(T. weissflogii)

由图5可知, 除个别数据外, 随着间苯二酚质量浓度的增加,T. weissflogii的生长量整体受到抑制, 质量浓度越大, 抑制现象越明显。间苯二酚的质量浓度为12mg/L时, 第7天时生长量相对于对照组的抑制率最大, 生长量只有对照组的73.9%。

图4 不同质量浓度间苯二酚对A. tamarense生长量的影响 Fig. 4 Effect of different concentration of resorcinol on the growth of A. tamarense

图5 不同质量浓度间苯二酚对T. weissflogii生长量的影响 Fig. 5 Effect of different concentration of resorcinol on the growth of T. weissflogii

2.2.3 绿色巴夫藻(P. viridis)

由图6可知, 对照组如预期的一样生长的最好, 随着间苯二酚质量浓度的增加,P. viridis的生长量相对于对照组的抑制率逐渐增大, 当间苯二酚的质量浓度为6mg/L时, 生长量是对照组的76.4%, 相对于其他实验组抑制率最大。

2.3 硝基苯对3种海洋微藻叶绿素a的影响

加硝基苯的实验组相对于对照组,A. tamarense叶绿素 a的含量均有下降趋势, 波动较大, 在3mg/L实验组, 叶绿素a含量最低, 仅为对照组的68.6%, 1.5mg/L实验组叶绿素a的含量相对最高, 为对照组的89.7%; 硝基苯对T. weissflogii叶绿素a的抑制现象不明显, 而在6mg/L实验组, 还促进了T. weissflogii叶绿素a含量增长, 高出对照组的0.7%, 在硝基苯质量浓度为12mg/L时, 叶绿素a含量受到抑制, 为对照组的89.17%, 与上述的生长量实验结论是一致的;P. viridis所有实验组中, 叶绿素a含量均小于对照组, 也就是说硝基苯对P. viridis叶绿素a 起到了抑制作用, 在12mg/L时, 抑制率最大, 叶绿素a的含量达到最低, 仅为对照组的41%。硝基苯对3种海洋微藻叶绿素a含量的影响(图7)主要表现在降低叶绿素a 的合成量, 其中对A. tamarense和P. viridis叶绿素a含量的影响呈现一定的剂量效应, 而对于T. weissflogii, 硝基苯对其叶绿素a的影响波动不大, 结论与相关文献报道不一致, 有待深入研究。

图6 不同质量浓度间苯二酚对巴夫藻生长量的影响 Fig. 6 Effect of different concentration of resorcinol on the growth of P. viridis

图7 不同质量浓度硝基苯对3种微藻叶绿素a含量的影响 Fig. 7 Effect of different concentration of nitrobenzene on the content of Chlorophyll a of 3 marine microalgae

2.4 间苯二酚对三种海洋微藻叶绿素a的影响

由图 8可知, 加间苯二酚后, 各实验组A. tamarense的叶绿素a含量均小于对照组, 但影响不明显, 6mg/L组与12mg/L组的叶绿素a的含量分别为对照组的90.14%、92%, 与上述生长量结论一致。间苯二酚对T. weissflogii叶绿素a含量的影响随质量浓度的增大而增大, 与对照组相比,T. weissflogii各实验组叶绿素a含量均有所下降, 6mg/L组与12mg/L组的叶绿素a的含量分别为对照组的58%、52%。相比较A. tamarense和T. weissflogii, 间苯二酚对P. viridis叶绿素a的影响更明显, 随着间苯二酚质量浓度的增加, 叶绿素a的含量在逐渐下降, 且在质量浓度为12mg/L时, 叶绿素a含量最低, 仅为对照组的1.1%。

3 结论

不同质量浓度的2种化学物质对供试的3种海洋微藻的生长均有一定程度的影响。其中硝基苯对A. tamarense和P. viridis的生长抑制作用随硝基苯质量浓度的增加抑制越明显。硝基苯对T. Weissflogii生长有一定的促进作用。间苯二酚对T. weissflogii和P. viridis的生长抑制作用随间苯二酚质量浓度的增加抑制越明显。而对于A. tamarense, 不同质量浓度的间苯二酚对其生长均有一定的促进作用。

图8 不同质量浓度间苯二酚对3种微藻叶绿素a含量的影响 Fig. 8 Effect of different concentration of resorcinol on the content of Chlorophyll a of 3 marine microalgae

硝基苯对A. Tamarense和P. Viridis叶绿素a含量的影响呈现一定的剂量效应, 对T. Weissflogii叶绿素a的影响不大; 间苯二酚对3种海洋微藻叶绿素a 含量影响程度有所差异, 其中对A. tamarense影响极不明显。

T. Weissflogii和A. tamarense在含硝基苯和间苯二酚组分的化工废水处理方面具有一定的潜在应用价值。

[1] 曹春晖, 孙世春, 麦康森, 等.30株海洋绿藻的总脂含量和脂肪酸组成[J].青岛海洋大学学报, 2000, 30(3): 428-434.

[2] 江红霞, 郑怡.8种微藻抗菌活性研究[J] .福建师范大学学报(自然科学版), 2002, 18(2): 117-120.

[3] Field C B, Behrenfeld M J, Randerson J T, et al. Primary production of the biosphere: integrating terresrtial and oceanic components [J]. Science, 1998, 281(5374): 237-240.

[4] Richmond A. Handbook of microalgal culture: Biotechnology and applied Phycology [M]. USA: Blackwell Publishing Company, 2003: 359-360.

[5] 王洪斌, 成 明, 盛 菊, 等 6种微藻生长及脂肪累积对氮含量变化的响应[J]. 水产科学, 2012,31(2): 79-82.

[6] 陈宇炜, 高锡云. 浮游植物叶绿素a含量测定方法的比较测定[J]. 湖泊科学, 2000, 12(2): 185-188.

[7] 杜庆才, 张德禄, 王高鸿, 等.莱茵衣藻生长和光合作用对硝基苯的响应[J].西北师范大学学报(自然科学版), 2007, 43(3):71-74.

[8] 沈洛夫, 姜建国, 林庆生, 等.硝基芳烃类物质对盐藻的毒性试验及比较[J]. 海洋科学, 2006, 30(5): 15-17.

[9] 许文武, 孟菁, 胡威, 等.5种酚类化合物对3种水生生物的毒性作用[J]. 环境化学, 2011, 30(10): 1751-1757.