血管紧张素Ⅱ1 型受体自身抗体在原发性肾小球疾病患者血清中的表达及意义*

熊 京， 杨慧敏， 朱 峰， 梁 莹， 刘建社， 张 春， 汪 洋

(华中科技大学同济医学院附属协和医院1肾内科，3心血管内科，4急诊科，湖北 武汉430022;2湖北省中医院心血管内科，湖北 武汉430061)

原发性肾小球疾病是中国人群中发病率占首位的肾脏疾病。虽其发病机制复杂且未完全阐明，但免疫介导的炎症反应是公认不争的研究方向。实验及临床研究均证实始发的免疫反应需引起炎症反应，且炎症反应持续存在和不断放大，才能导致肾小球损伤及其临床症状［1-2］。近年来先兆子痫的研究发现，子宫-胎盘血流灌注减少，缺血缺氧导致血管内皮损伤，而内皮细胞功能紊乱可触发血管紧张素II 1型受体自身抗体(angiotensin Ⅱtype 1 receptor agonistic autoantibodies，AT1-AA)的产 生［3-4］。AT1-AA作用于AT1受体，上调各种炎症介质的表达，又进一步加重缺血缺氧、血管内皮损伤和炎症反应，导致更多的AT1-AA 生成，形成恶性循环，不断地放大炎症反应，加重炎性损伤［5-6］。至今为止，AT1-AA 已被报道参与了血管炎、先兆子痫、恶性高血压和移植肾排斥反应等多种疾病的发病机制［3，7］。肾素-血管紧张素-醛固酮系统在肾小球疾病的发生及进展过程中发挥了重要的作用［8］，但AT1-AA 在肾小球疾病中的作用却鲜为人知。因此我们对300 多例原发性肾小球患者进行了调查，探讨AT1-AA 是否参与了肾小球疾病的发病机制，以及它与肾小球疾病的各临床和病理分型之间的相关性。

材 料 和 方 法

1 研究对象

2009 年4 月～2010 年1 月期间于武汉协和医院肾内科住院的原发性肾小球疾病患者326 例。入选标准:经临床病史、家族史、实验室检查结合肾活检病理学检查，排除肾囊肿、泌尿系结石及继发性肾小球疾病(如系统性红斑狼疮、糖尿病、高血压、过敏性紫癜、乙型肝炎、恶性肿瘤、风湿性疾病等)，确诊为原发性肾小球疾病，诊断明确。所有患者12 周内均未使用过血管紧张素转换酶抑制剂(angiotensin-converting enzyme inhibitor，ACEI)或血管紧张素受体II阻滞剂(angiotensin Ⅱreceptor blocker，ARB)类药物。排除标准:恶性高血压，定义为舒张压(diastolic blood pressune，DBP)≥130 mmHg。

患者组的分组标准如下:(1)根据在过去的12周内是否曾口服和(或)静脉注射过糖皮质激素类药物、环磷酰胺、雷公藤、环孢霉素A、他克莫司、来氟米特、吗替麦考酚酯、甲氨蝶呤等，分成有免疫抑制剂用药史组(用药组)和无免疫抑制剂用药史组(未用药组)。(2)根据有无高血压分为高血压组和非高血压组。高血压判定方式采用2000 年WHO/ISH 诊断标准:收缩压(systolic blood pressure，SBP)≥140 mmHg 和(或)DBP≥90 mmHg 认定为患有高血压;患者既往有高血压史，目前正服用抗高血压药物，即使血压已低于140/90 mmHg，仍列入高血压组。(3)根据AT1受体自身抗体的检测结果分为AT1-AA(+)组和AT1-AA(-)组。正常对照组197 例，来自本院体检中心健康体检者，胸部正侧位片、心电图、肝肾功能电解质、血糖血脂、心肌酶及血常规、尿常规等检查均未见异常。

2 临床和病理资料采集

详细询问病史:年龄、性别和既往史。测量血压。检测血、尿标本各项指标，包括:血清白蛋白(albumin，ALB)、血清球蛋白、血尿素氮、血清肌酐、血糖、血清胆固醇、血清甘油三酯、24 h 尿蛋白定量、血抗心磷脂抗体、尿N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶(N -acetyl-β-glucosaminidase，NAG)、尿视黄醇结合蛋白(retinol-binding protein，RBP)、尿ALB、尿免疫球蛋白G(immunoglobulin G，IgG)和尿补体3(complement 3，C3)等。B 超引导下行经皮肾穿刺活检术，肾组织常规行苏木精- 伊红(hematoxylin-eosin，HE)染色、过碘酸- 希夫(periodic acid-Schiff，PAS)染色、过碘酸-六胺银染色(periodic acid-silver metheramine，PASM)和Masson 三色染色，光镜、免疫荧光及电镜检查。

3 ELISA 法检测血清AT1-AA

AT1受体多肽合成:采用多肽自动合成仪(SHIMADZU PSSM-8)，用固相多肽合成法合成具有抗原决定簇的AT1受体细胞外第2 环多肽片段。多肽片段序列参照文献［7］。高压液相色谱分析合成肽的纯度，纯度在95%以上。ELISA 法检测自身抗体:参照本院心内科实验室建立的方法［7］，检测AT1-AA。

4 统计学处理

采用SPSS 17.0 统计软件处理。计量资料以均数±标准差(mean ±SD)表示，正态分布的两组样本均数比较，方差齐者采用t 检验，不齐者采用t’检验;非正态分布的两组样本均数比较用非参数检验。计数资料以率表示，两样本率的比较采用χ2检验。以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

结 果

1 AT1-AA 在原发性肾小球疾病患者血清中的表达

原发性肾小球疾病患者组的AT1-AA 阳性率明显高于正常对照组(P ＜0.01)，见表1。

表1 AT1-AA 在原发性肾小球疾病患者中的表达Table 1. Expression of AT1-AA in the patients with primary glomerulopathy

2 免疫抑制剂对AT1-AA 检测结果的影响

考虑到免疫抑制剂能抑制机体的免疫反应过程，干扰体内抗体的生成，从而可能造成AT1-AA 检测结果的假阴性，故将326 例原发性肾小球疾病患者分成用药组和未用药组后，比较两组的AT1-AA 阳性率。如表2 所示，用药组的AT1-AA 阳性率明显低于未用药组(P ＜0.05)，证实了免疫抑制剂的确会干扰AT1-AA 的检测结果，故后面的分析研究仅在未用药组患者中进行。

表2 免疫抑制剂对AT1-AA 检测结果的影响Table 2. Effect of immunosuppressive agents (ISA)on AT1-AA detection

3 AT1-AA 在未使用免疫抑制剂的原发性肾小球疾病患者血清中的表达

未用药患者组共计280 例，其中141 例为女性，139 例为男性，女性患者所占比例为50.36%;平均年龄(36.47 ±14.21)岁;非高血压组143 例，高血压组137 例。正常对照组共计197 例，其中60 例为女性，137 例为男性，女性患者所占比例为30.46%;平均年龄(47.79 ±12.43)岁;均无高血压。未用药患者组的AT1-AA 阳性率达38.21%，而正常对照组仅为9.64%，两者有显著差异(P ＜0.01)，见表3。

表3 AT1-AA 在未使用免疫抑制剂的原发性肾小球疾病患者中的表达Table 3. Expression of AT1-AA in primary glomerulopathy patients without immunosuppressive agents (ISA)

4 原发性肾小球疾病患者AT1-AA 的表达与高血压发病率的关系

非高血压组和高血压组的AT1-AA 阳性率均显著高于正常对照组(P ＜0.01);但非高血压组和高血压组之间AT1-AA 阳性率的差异无统计学意义(P ＞0.05)，提示在肾小球疾病患者中，AT1-AA 与高血压的发生可能无明显的相关性，见表4。

表4 高血压对原发性肾小球疾病患者AT1-AA 阳性率的影响Table 4. Effect of hypertension (HT)on the positive rate of AT1-AA in the patients with primary glomerulopathy

5 AT1-AA 与原发性肾小球疾病各临床/病理类型之间的关系

按照临床诊断，我们将280 例未使用免疫抑制剂的原发性肾小球疾病患者分成4 组:急性肾小球肾炎(acute glomerulonephritis，AGN)组、隐匿型肾小球肾炎(latent glomerulonephritis，LGN)组、慢性肾小球肾炎(chronic glomerulonephritis，CGN)组和肾病综合症(nephrotic syndrome，NS)组。比较各组之间的AT1-AA 阳性率，结果AGN 阳性率(25%)较其它组稍低，但各组间差异均无统计学意义(P ＞0.05)，见表5。

表5 不同临床类型的肾小球疾病患者AT1-AA 阳性率的比较Table 5. Comparison of the positive rate of AT1-AA in the glomerulopathy patients with different clinical patterns

280 例未用药组患者中进行了肾活检病理学检查者共196 例，包括膜增生性肾小球肾炎(membrano-proliferative glomerulonephritis，MPGN)患者2 例、膜性肾病(membranous nephropathy，MN)患者12例、局灶节段性肾小球硬化(focal segmental glomerulosclerosis，FSGS)患者12 例、IgA 肾病(IgA nephropathy，IgAN)患者63 例和系膜增生性肾小球肾炎(mesangial proliferative glomerulonephritis，MsPGN)患者107 例。5 种病理类型之间AT1-AA 阳性率的差异均无统计学意义(P ＞0.05)，见表6。

表6 不同病理类型的肾小球疾病患者AT1-AA 阳性率的比较Table 6. Comparison of the positive rate of AT1-AA in the glomerulopathy patients with different pathological patterns

6 AT1-AA 与各临床参数之间的关系

AT1-AA(+)组的患者年龄大于AT1-AA(-)组(P ＜0.05);AT1-AA(+)组女性患者所占比例高于AT1-AA(-)组(P ＜0.01);AT1-AA(+)组的血清球蛋白水平高于AT1-AA(-)组(P ＜0.01);其余各项临床参数之间在两组间的差异均无统计学意义(P ＞0.05)，见表7。

表7 AT1-AA 与各临床参数的单因素分析Table 7. The univariate analysis of AT1-AA and different clinical parameters

将年龄、性别、SBP、DBP 及血清球蛋白进行logistic 回归分析发现:性别和血清球蛋白与AT1-AA的相关度分别为1.946(95%CI 1.160 ～3.264)和1.087(95%CI 1.025 ～1.152)。年龄、SBP 和DBP 与AT1-AA 的相关性无统计学意义，见表8。

表8 AT1-AA 与各临床参数的多因素logistic 回归Table 8. The multivariate logistic regression analysis of AT1-AA and different clinical parameters

讨 论

1999 年Wallukat 等［3］在先兆子痫患者血清中检测到AT1-AA，随后在恶性高血压、移植肾排斥反应等患者血清中也相继发现高表达的AT1-AA。AT1-AA 被认为是AT1受体的激动剂，与多器官的血管损伤有关系。本研究通过对300 多例原发性肾小球疾病患者的调查发现，患者血清中AT1-AA 的阳性率显著高于正常人群(P ＜0.01)，提示AT1-AA 可能参与了原发性肾小球疾病的发病机制。另外，进一步分组发现，无论非高血压组或高血压组原发性肾小球疾病患者的AT1-AA 阳性率均明显高于正常对照组(P ＜0. 01)，但非高血压组和高血压组患者之间AT1-AA 阳性率的差异并无统计学意义(P ＞0.05)，提示AT1-AA 的致肾小球疾病机制可能独立于致高血压因素之外。

目前已证实，AT1-AA 与ATl 受体结合后可通过以下几个途径激活炎症反应:(1)影响细胞内多种转录因子的活性，上调参与炎症反应和凝血过程的靶基因的表达，促使多种炎症介质和细胞因子的合成和分泌［7］;(2)生成的多种炎症介质如组织因子、纤溶酶原激活物抑制物1、活性氧等，进一步加重缺血缺氧、血管内皮损伤及炎症反应，导致更多的AT1-AA 生成，形成恶性循环，不断放大炎症反应，加重炎性损伤［9-10］;(3)AT1-AA 与ATl 受体结合后，促进抗原递呈细胞递呈抗原、趋化因子的产生以及Th1 细胞产生细胞因子，放大局部炎症反应［11-12］;(4)AT1-AA 具有不随时间而失敏感的受体激动剂样活性，导致炎症反应持续存在和不断放大。众所周知，肾小球内持续存在和不断放大的炎症反应是原发性肾小球疾病发病机制中的关键环节。因此我们推测:高表达的AT1-AA 诱发的持续炎症反应可能是原发性肾小球疾病的重要发病机制。另外，本研究显示近期使用过免疫抑制剂的患者AT1-AA 阳性率明显低于无用药史的患者，提示免疫抑制剂能有效地抑制AT1-AA 的生成，减少AT1-AA 的致病作用，从而延缓病情的进展。

我们进一步分析了AT1-AA 与原发性肾小球疾病患者临床参数和临床病理分型之间的关系。既往研究发现，AT1-AA 与AT1受体结合后既可直接刺激血管平滑肌细胞胞质游离钙水平增高、导致血管收缩以及刺激心肌细胞搏动频率增加，也具有介导心血管重构的作用，从而参与恶性高血压的病变过程［4，13］。在本研究中，我们将恶性高血压患者排除后发现，非恶性高血压组与正常血压组之间的AT1-AA 阳性率无统计学差异(P ＞0. 05);且AT1-AA(+)组与AT1-AA(-)组的SBP 和DBP 进行比较，结果亦无统计学差异(P ＞0.05)，提示非恶性高血压与AT1-AA 之间可能无明显相关性。Fu 等［14］提出，在非恶性高血压患者中可能存在某种因素，可以增强患者的免疫耐受性，从而负性调节免疫反应，而恶性高血压中则不存在该因素。另外，单因素分析和logistic 回归分析结果显示:一般临床参数和实验室参数中，仅性别和血清球蛋白与AT1-AA 的水平具有相关性。AT1-AA(+)组中女性患者所占比例明显高于AT1-AA(-)组;同期研究也发现狼疮性肾炎患者AT1-AA 阳性比率较正常对照组也明显增高［15］。众所周知，女性自身免疫性疾病(包括狼疮)的发病率要高于男性，对于自身免疫性疾病与性别差异之间关系的研究前景正越来越受到科学家们的青睐，两性之间性激素的不同是产生这种差异的重要原因。AT1-AA 属于补体结合性的IgG1和IgG3抗体［14］，我们的统计结果也证实AT1-AA(+)组的血清球蛋白水平高于AT1-AA(-)组(P ＜0.05)。

不管根据临床或病理分类，各类型患者中均检测出较高水平的AT1-AA 阳性率，且各组间AT1-AA阳性率的差异均无统计学意义(P ＞0. 05)。虽然MPGN 患者的AT1-AA 阳性率达100%，但由于其病例数仅为2 例，故二者之间的关系尚有待进一步的观察。临床分类方面，慢性肾小球肾炎AT1-AA 阳性率最高，急性肾小球肾炎阳性率最低，但差异未达统计学意义(P ＞0.05)。故无论从临床还是病理方面进行分型，AT1-AA 似乎都不是某一类型的原发性肾小球疾病的特异性抗体。

总之，我们通过对大量原发性肾小球肾炎患者临床和病理资料的统计学分析发现，AT1-AA 可能是参与原发性肾小球疾病发病机制的重要因素。该发现为肾小球疾病的防治研究提供了新的理论基础。但目前仍存在很多疑问，如:AT1-AA 与慢性肾小球疾病之间到底谁是因，谁是果，还是互为因果?AT1-AA 致肾小球疾病的发病机制是什么?抑制AT1-AA的产生能够预防和治疗肾小球疾病吗?这些问题的解答都需要进一步的实验室和临床研究。

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