香港远志黄酮苷对局灶性脑缺血大鼠神经保护及TGF-β、HSP70含量影响

詹海涛,吴剑峰,李海燕,孟红旗,曾煦欣

(佛山科学技术学院 临床医学系,广东 佛山 528000)

缺血性卒中发作前给予预适应药物,使脑组织处于预适应状态,产生保护作用,对于防治急性缺血性脑血管病,具有显著的有效性。本研究应用大脑中动脉闭塞(MCAO)模型大鼠,观察香港远志(Polygala hongkongensis)黄酮苷预处理,对大鼠神经行为缺损评分(NBDS)、脑梗死体积(IV)、血清神经元烯醇化酶(NSE)、脑组织转化生长因子β(T GF-β)和热休克蛋白70(HSP70)含量的影响,为临床应用提供研究依据。

1 材料与方法

1.1 香港远志黄酮苷的提取、分离与鉴定

香港远志药材采自广东,采用硅胶、Sephadex LH-20、半制备高效液相色谱等技术,对香港远志全株的70%甲醇提取物进行分离纯化,运用红外光谱(IR)、紫外光谱(UV)、质谱(HRESI-MS、ESI-M S)及核磁共振光谱 (1H NM R、 13C NMR、 DEPT、 1H-1HCOSY、 HMQC、 HMBC、NOESY)等波谱学技术 ,鉴定出单体化合物:山柰酚-3-0-葡萄糖苷(PHN-08)、山柰酚-3-0-芸香糖苷(PHN-11)。

1.2 动物分组及给药

体质量280～ 300 g雄性SD大鼠(广东省医学实验动物中心提供),随机分5组,假手术组、模型组和干预组(PHN-08组、PHN-11组及合方组),每组28只。将 PHN-08、PHN-11制备成2种注射液,每mL分别含 PHN-0812 mg及 PHN-1116 mg,合方为上述 2种组分以单组分含量等比混合。MCAO前1周给药,生理盐水稀释按每天 4 m L/kg腹腔注射,每天1次,假手术组、模型组按相同方式给等量生理盐水。各组大鼠室温下自由进食、进水,在设定时间测定相关指标。

1.3 MCAO模型制备

线栓法[1]制备MCAO模型,加热直径0.20 mm尼龙线顶端,制成直径为0.25 mm光滑球状,10%水合氯醛腹腔注射麻醉(350 mg/kg),颈部纵行切口,分离右侧颈总动脉(CCA)、颈内脉(ICA)、颈外动脉(ECA),结扎CCA近心端及 ECA近分叉部,充分游离 ICA。沿ICA方向插入顶端直径0.25 mm尼龙线至有阻力为止(约 20 mm),于近心端结扎 ICA。动物苏醒后左侧肢体偏瘫为造模成功,假手术组不插线栓,余操作同上。

1.4 相关指标测定

(1)神经行为缺损评分(neurological behavior deficits scores,NBDS)测定。各组随机取12只大鼠,采用 Longa等[2]评分法,评估 MCAO后 24 h的 NBDS。 0分,正常;1分,左侧前肢内旋、内收;2分,行走向左侧转圈;3分,行走向左侧倾倒;4分,无自主活动。

(2)脑梗死体积(IV)百分比测定。 NBDS后即断头取脑,置-20°C冰箱冷冻 10 min,从大脑半球额极至枕极连续冠状切6片(片厚2 mm),置 2%的 T TC溶液(37°C)中避光孵育30 min,正常组织呈红色,梗死区呈白色,用图像分析软件处理。每只动物梗死体积为脑片梗死面积乘以厚度(2mm)后之和。为校正脑水肿偏差,IV(%)=(手术对侧正常大脑体积-手术同侧正常体积)/手术对侧正常大脑体积×100%。

(3)血清神经元烯醇化酶(NSE)测定。NBDS后即断头取血,标本3000 r/min离心3 min,血清置-20°C冰箱待测。应用NSE-ELISA法测定血清NSE含量,试剂盒由北京北方生物技术研究所提供,按说明书要求操作测定 (单位:ng/mL)。

(4)TGF-β、HSP70测定。分别于 MCAO后 12 h及 24 h,各组随机取 8只大鼠,断头处死,置冰盘速取缺血侧大脑纹状体和皮层组织,加冰生理盐水(2.5 mL/g),冰浴匀浆后置4°C离心机中,3500 r/min离心15 min,取上清液置-20°C冰箱备测。酶联免疫吸附法测TGF-β(ng/L)、HSP70(μ g/L)含量(TGF-β和 HSP70定量 EIA Kit分别购自上海森雄实业有限公司及北京欣圣荣公司,按说明书操作要求测定)。

1.5 统计学分析

采用SPSS 13.0软件进行分析,数据以x±s表示,两样本间比较用t检验,多组间比较采用方差分析,P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 NBDS测定

假手术组无神经行为缺损,模型组与干预组出现神经行为缺损。与模型组比较,干预组NBDS显著减低(PHN-08组及 PHN-11组 P＜0.05,合方组 P＜0.01),如表1所示。

表1 香港远志黄酮苷对局灶性脑缺血大鼠 NBDS、IV、N SE影响(±s)

表1 香港远志黄酮苷对局灶性脑缺血大鼠 NBDS、IV、N SE影响(±s)

注:与假手术组比较:*P＜0.01;与模型组比较:△P＜0.05,△△P ＜0.01。

组别 n NBDS IV/% N SE/(ng· mL-1)假手术组 12003.96±0.79模型组 123.41± 0.7031.96± 5.288.97± 2.15*PHN-08组 122.90± 0.41△ 27.63± 4.72△ 7.18±1.94*△PHN-11组 122.85± 0.36△ 26.92± 4.05△ 6.91±1.73*△合方组 122.66±0.32△△ 26.01±3.84△△ 6.54±1.25*△△

2.2 IV百分比测定

假手术组无梗死灶,模型组与干预组右侧额顶叶、尾状核与壳核外侧部出现梗死灶。与模型组比较,干预组 IV显著减小(PHN-08组及 PHN-11组 P＜0.05,合方组 P＜0.01),如表1所示。

2.3 NSE测定

模型组及干预组的 NSE含量显著高于假手术组(P＜0.01),干预组显著低于模型组(PHN-08组及PHN-11组 P＜0.05,合方组 P＜0.01),如表1所示。

2.4 TGF-β测定

脑缺血12 h,模型组及干预组TGF-β含量显著高于假手术组(模型组、PHN-11组P＜0.05,PHN-08组、合方组P＜0.01),与模型组比较,PHN-08组、合方组含量显著增高(P＜0.05)。脑缺血24 h,模型组及干预组 TGF-β含量较假手术组显著增高(P＜0.01),与模型组比较,干预组含量显著增高(P＜0.05),如表2所示。

2.5 HSP70测定

脑缺血12 h,模型组及干预组HSP70含量较假手术组显著增高(P＜0.01),模型组与干预组间含量无显著性差异。脑缺血 24 h,模型组及干预组 HSP70含量较假手术组显著增高(P＜0.01),与模型组比较,干预组含量显著增高(PHN-08组、PHN-11组P＜0.05,合方组 P＜0.01),如表2所示。

表2 香港远志黄酮苷对局灶性脑缺血大鼠脑组织 TGF-β、HSP70含量影响(±s)

表2 香港远志黄酮苷对局灶性脑缺血大鼠脑组织 TGF-β、HSP70含量影响(±s)

注:与假手术组比较:*P＜0.05,**P＜0.01;与模型组比较:△P＜0.05,△△P ＜0.01。

组别 n TGF-β/(ng· L-1)HSP70/(μg· L-1)脑缺血 12h 脑缺血24h 脑缺血 12h 脑缺血 24h假手术组 81.63± 0.711.68± 0.6370.63± 7.9165.38± 7.41模型组 82.59± 0.83* 14.19± 3.58** 121.47± 37.08** 127.83± 41.72**PHN-08组 83.52±0.87**△ 18.39±4.16**△ 138.20±40.13** 175.31± 46.25**△PHN-11组 82.50±0.79* 18.63± 4.31**△ 158.32±47.01** 180.16± 43.54**△合方组 83.57±0.85**△ 19.67± 3.81**△ 153.91±45.74** 194.27± 45.18**△△

3 讨论

药理性预适应(pharmacological preconditioning)通过预先激活机体内源性保护机制,发挥对脑组织的保护作用,其防治急性缺血性脑血管病的有效性,已成为近年国内、外的研究热点[1-2]。但开发疗效理想的预适应药物,仍需大量深入的药物筛选研究,在此领域,植物药具有独特的开发应用前景。远志属的多种植物在我国应用普遍且药效多样,其安神益智作用,在文献古籍、经方记载中出现频率较高,现代药理研究表明其具有提高学习记忆力、脑保护和抗痴呆作用。香港远志(Polygala hongkongensis)系远志科(Polygalaceae)远志属植物,在民间以全草入药,具有活血、化瘀、解毒之功效[3]。本研究首次选用香港远志,观察其有效组分黄酮苷 (PHN-08、PHN-11)对 MCAO模型大鼠,NBDS、IV、NSE、TGF-β和HSP70含量的影响,探究其脑神经保护作用与作用机制。

NBDS、IV与 NSE可分别从功能学、形态学及血液生化等方面,反映急性缺血性脑损伤的严重程度。本研究显示,假手术组大鼠未出现神经行为缺损及梗死灶形成,模型组与干预组均出现不同程度神经行为缺损及梗死灶,血清NSE含量较假手术组显著增高。提示由于 MCAO引发的神经元损伤、梗死灶形成,导致显著的神经功能障碍。与模型组比较,各干预组的NBDS、IV、NSE有显著性改善,其中合方组改善更加显著,表明香港远志黄酮苷预处理,对MCAO大鼠急性脑损伤产生良好的保护作用。

T GF-β由活化的 T细胞和单核 /巨噬细胞产生,其中 TGF-β1在缺血性脑损伤时,发挥显著的多靶点脑保护功能。研究显示,TGF-β1可通过刺激星形胶质细胞分泌神经生长因子(NGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和脑元性神经生长因子(BDNF),促进神经元的存活和分化[4-5],T GF-β1可促进体外培养原代小脑神经元树突生长及促进突触素1表达的增多[6]。本研究显示,脑缺血12 h,模型组及干预组 TGF-β含量显著高于假手术组,随时间推移,至脑缺血 24 h呈进一步增高趋势,可能与脑组织损伤程度随时间推移不断加重相关。与模型组比较,脑缺血 12 h,PHN-08组、合方组的含量显著增高;脑缺血24 h,各干预组的含量均显著上升。这表明香港远志黄酮苷对MCAO大鼠急性脑损伤的保护作用,可能通过单体化合物或(和)有效组分协同作用,调控 TGF-β的表达,发挥生物学效应,且各效组分调控作用有时序性差异。

HSP70主要由中枢神经系统的神经元、胶质细胞和血管内皮细胞产生,生理状态下其含量很低,当细胞受热或化学应激时表达增加。脑缺血损伤时,谷氨酸摄氧功能降低,兴奋性氨基酸堆积导致神经元损伤,可使HSP70表达增高。研究发现 HSP70具有保护脑细胞、增强抗损伤、促进脑细胞修复等作用[7]。本研究显示,脑缺血12h,模型组及干预组的HSP70含量已显著高于假手术组,至脑缺血24h,呈进一步增高趋势,表明 HSP70的表达与脑损伤的程度及持续时间相关。脑缺血 12 h,模型组与各干预组间的HSP70含量无显著性差异,提示香港远志黄酮苷此时段未发挥生物效应。脑缺血24 h,与模型组比较,各干预组的HSP70均有显著表达,其中合方组效应最强。单一组分与组分配伍间的效果差异,或许因组分配伍后造成药物特性或药物作用环境改变所致。表明香港远志黄酮苷可能通过促进 HSP70的表达,对MCAO大鼠急性脑损伤发挥保护作用,且与损伤持续时间、严重程度及有效组分的协同作用等有关。

本研究结果表明,香港远志有效组分黄酮苷预处理,对局灶性脑缺血模型大鼠具备脑保护作用,其作用机制可能是增强 TGF-β和 HSP70的表达,延缓或阻止缺血后神经元死亡进程,防止梗死灶扩大、改善神经行为缺损,从而显示出有效的药理性预适应作用。新近的研究证实[8-10],香港远志有效成分具有抗氧化、抑制凋亡基因表达作用。更为明确的作用机制,有待进一步研究TGF-β和HSP70的高表达与抗氧化、抑制凋亡基因的相互关系;有效组分间的协同作用、疗效的时序性以及是否影响其他递质或分子。

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