超滤质谱法研究大黄蒽醌类化合物与人血清白蛋白的相互作用

王 献，喻 花

(中南民族大学 化学与材料科学学院，武汉 430074)

在药物小分子与蛋白质相互作用的研究中，质谱法受到了广泛地应用.超滤质谱技术是一种新的分析方法，它结合了超滤装置的分离功能和质谱技术的分析优势，能够迅速有效地检测和鉴别出与受体蛋白质相结合的配体小分子.故超滤质谱技术可应用于先导化合物的筛选[1,2]，组合文库的筛选[3,4]，天然产物有效成分的筛选[5,11].此外，超滤质谱技术具有分析速度快、特异性强、高通量的特点，且样品用量少、图谱信息量大，因此在药物小分子和生物大分子相互作用的研究方面具有巨大的优势.

大黄(RadixetRhizomaRhei)为蓼科植物掌叶大黄RheumPalmatumL.唐古特大黄RheumtanguticumMaxim.ex Balf或药用大黄RheumofficinaleBaill的干燥根和根茎，味苦、性寒.临床研究证明，大黄具有抗衰老、降血脂、抗肿瘤、泻下作用及抗菌、消炎、止血等多种生理活性[12].大黄的主要有效成分为蒽醌类衍生物：大黄素、大黄酸、大黄酚、大黄素甲醚、芦荟大黄素及它们与葡萄糖结合成的苷类[13].

本文采用超滤质谱法研究了人血清白蛋白(HSA)与3种蒽醌类化合物(大黄酚、大黄酸和芦荟大黄素)的相互作用，通过提取离子色谱峰比较了这几种药物与HSA的相对结合能力，在此基础上建立并优化了一套超滤质谱法，可应用于研究和筛选与生物靶分子结合的药物.

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

高效液相色谱仪(Agilent 1200，美国安捷伦科技有限公司)，四极杆飞行时间质谱仪(Agilent 6520 Q-TOF MS，美国安捷伦科技有限公司)，高速冷冻离心机(GL-20M，上海卢湘仪离心机仪器有限公司)，超滤膜YM-10(美国Millipore 公司，理论截取分子量10 kDa)，超纯水机(Molelement 1815a摩尔元素型，上海摩勒科学仪器有限公司).

人血清白蛋白(HSA，美国Sigma)，大黄酚、大黄酸、芦荟大黄素纯度均≥98％(上海拉丁试剂)，甲醇、乙腈均为色谱纯(德国Merck公司)，其他试剂均为优级纯.

1.2 样品制备

将HSA溶解于超纯水中，配制成100 μM的蛋白质母液，离心，于4℃下冷藏保存.分别准确取一定质量的大黄酚、大黄酸、芦荟大黄素3种化合物，用甲醇溶解，配置成100 μM的蒽醌类化合物混合溶液母液，离心，于4℃下冷藏保存.超滤实验前，用超纯水5倍稀释蛋白和药品溶液母液得到20 μM工作液.

1.3 仪器条件

1.3.1 色谱条件

C18色谱柱(150mm×4.6mm×5 μm)，柱温40℃，流速0.2 mL/min.液相色谱梯度洗脱条件：流动相A为超纯水，B为乙腈；t=0 min，99％ A(1％ B)；t=0～6 min，30％ A(70％ B)；t= 6～15 min，1％ A(99％ B)；t=15～25 min，1％ A(99％ B)；t=25～30 min，99％ A(1％ B)，进样量为5 μL.

1.3.2 质谱条件

电喷雾离子源(ESI)，负离子模式检测，离子扫描范围50～600m/z，干燥气温度350℃，干燥气流速12 L/min，雾化器压力40 psig，毛细管电压4000V，碎裂电压125V.

1.4 超滤实验

吸取20 μL三种化合物的混合工作液，20 μL (20 μM)HSA和160 μL 超纯水混合均匀，室温反应2 h，置于YM-10超滤管中，10000 r/min离心15 min，用200 μL超纯水离心清洗滤膜，重复3次，将未结合的配体小分子充分清洗干净.再向滤膜中加入水/甲醇(50︰50,v/v)，静置30 min，10000 r/min离心15 min，将药物小分子从HSA上解离下来，用200 μL水/甲醇(50︰50,v/v)离心清洗滤膜，重复3次，收集洗脱液于进样瓶中，用LC-MS检测.实验以不加入蛋白质的空白实验为对照组，结合组和对照组均平行实验3次以上.

2 结果与讨论

2.1 标准品混合溶液色谱质谱联用(LC-ESI-MS)测试条件优化

首先建立标准品混合物LC-ESI-MS分析测试方法.将大黄酸、芦荟大黄素和大黄酚3种物质配成最终浓度为2 μM的混合溶液，它们的摩尔浓度比为1︰1︰2，优化LC-ESI-MS条件对标准品混合溶液进行分离测试，结果见图1.

t/min

由图1可见，通过优化测试的色谱、质谱条件，混合样品溶液在C18柱中得到了有效分离，峰形较为对称，17 min内可完成对这3种组分的分离.3种大黄蒽醌类化合物分子式、理论同位素分子量M及形成去质子分子离子[(M-H)-]离子质量见表1.

表1 3种大黄蒽醌类物质分子式、精确分子量和形成负离子的质量

EIC图中3组峰分别所对应的ESI-MS质谱图见图2.对比表1可知，图2(a)中m/z为283.0287,269.0491,253.0534的分别是大黄酸、芦荟大黄素、大黄酚的[(M-H)-]峰，故根据质谱图可以确定图1中3种物质1、2、3分别为大黄酸、芦荟大黄素、大黄酚.

m/z

2.2 大黄蒽醌类化合物和人血清白蛋白的竞争性结合实验

超滤实验完成后，收集解离下来的大黄蒽醌类化合物混合溶液进LC-MS检测，检测条件参照标准品测试条件.对所得的总离子流图(TIC)进行3种大黄蒽醌类化合物的精确分子量的提取离子分析，结果见图3.如图3所示，结合组的3个提取离子流图 (EIC)色谱峰(即加入蛋白组，实线所示)均在不同程度上高于对照组(即未加蛋白质组，虚线所示)对应的EIC色谱峰.相同的色谱、质谱条件下，EIC色谱峰的积分面积与溶液中该物质的浓度成正比，通过实验组和空白组的EIC色谱峰锋面积差异可知3种大黄蒽醌类化合物和HSA均有不同程度的结合，其中大黄酸的结合能力较强，其次是芦荟大黄素，大黄酚的结合能力最弱.

图3中3组峰分别对应的ESI-MS质谱图(图略)与标准溶液图2一致，分别对应保留时间为8.942,12.636,16.565 min的质谱图.由Q-TOF MS给出的精确分子量信息可知，m/z为283.0287的是大黄酸的[(M-H)-]峰，m/z为269.0491的是芦荟大黄素的[(M-H)-]峰，m/z为253.0534的是大黄酚的[(M-H)-]峰.根据质谱图可以确定图3中3种物质按照洗脱时间顺序依次为大黄酸、芦荟大黄素、大黄酚，与上述标准品的色谱峰保留时间一致.

t/min

3 结语

本文通过构建超滤质谱法研究大黄蒽醌类化合物和人血清白蛋白的相互作用，实验结果表明大黄酸、芦荟大黄素、大黄酚3种药物均可与HSA结合，相对结合强度为大黄酸﹥芦荟大黄素﹥大黄酚，验证了超滤质谱法是一种研究配体和蛋白质的相互作用快速灵敏有效的分析方法.超滤实验中同时考虑配体和蛋白质的浓度、孵育时间、解离溶剂的选择、超滤膜的选择等，获得了准确可靠的实验数据.该超滤质谱方法可广泛应用于对与各类生物靶分子相互作用的天然产物和药物的筛选工作.

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