ICAM-1在儿童肿瘤中表达的临床意义

黄 珂 陈艳红

近年来，在儿童肿瘤中应用以细胞因子诱导杀伤(cytokine-induced killer，CIK) 细胞输注为主导的细胞过继免疫治疗已经逐渐受到重视。与CIK细胞杀伤激活关系密切的细胞间黏附分子-1( intercellularadhesionmolecule-1，ICAM-1，CD54)的研究越来越得到关注。肿瘤细胞表达的 ICAM-1与 CIK 细胞上表达的淋巴细胞功能相关抗原-1(lymphocyte function associated antigen-1，LFA-1) 相互作用是 CIK 细胞杀伤、识别肿瘤细胞的主要机制。本研究拟检测儿童肿瘤细胞 ICAM-1 表达水平并分析其临床意义。

1 材料与方法

1.1 一般资料

选择我院2008年1月1日-2012 年12 月31日收治的儿童肿瘤患者共85例，分为实体瘤和非实体瘤(白血病)。实体瘤35例，其中淋巴瘤10 例，肝母细胞瘤2例，神经母细胞瘤4例，横纹肌肉瘤2 例，尤文氏肉瘤4例，原始神经胚层肿瘤4 例，肾母细胞瘤9 例。非实体瘤指急性白血病(acute leukemia，AL)50例，包括急性淋巴细胞白血病(acutelymphocytic leukemia，ALL) 20 例和急性髓系白血病(acute myelocytic leukemia，AML) 30 例。AML中部分分化性粒细胞性白血病(M1)、分化性粒细胞性白血病(M2)、早幼粒细胞性白血病(M3) 型共 18 例，粒单细胞性白血病(M4)、单核细胞性白血病(M5)型共12 例。所有患儿均进行骨髓象形态学和细胞化学、细胞免疫分型检测和确诊。选取健康移植供者骨髓20 例作为对照组。

1.2 研究方法

1.2.1 检测方法 ①实体瘤：手术切取患儿肿瘤实体组织制取的石蜡切片，采用免疫细胞化学方法检测切片组织的 ICAM-1 表达水平。组织切片常规二甲苯脱蜡、梯度酒精脱水，放入新配制的 3% 过氧化氢甲醇 37℃孵育10 min，阻断灭活内源性过氧化物酶，蒸馏水洗 3 次。微波修复抗原，滴加血清封闭液 20 min。滴加 ICAM-1 一抗4℃冰箱孵育 60 min，用 PBS 冲洗3～5 min，滴加生物素标志的 IgG 二抗37℃孵育20 min，滴加SABC(链霉卵白素+ 辣根酶标记生物素) 20 min，DAB染色液 10 min显色，苏木精染色液染色 5 min，常规进行脱水、透明、干燥、封片。②白血病：取流式细胞仪(FACSCalibur)专用试管 1 支，加入多甲藻黄素-叶绿素-蛋白质复合物(Percp)标记的 CD45 单克隆抗体10 μl/孔，再加入藻红蛋白(PE )标记 ICAM-1 单克隆抗体10 μl/孔，加入 EDTA-K2抗凝的骨髓 50 μl/孔，低速涡流混匀，37℃避光反应 20 min。加入BD FACS lysing solution溶血素 1 ml，混匀，37℃避光保存10 min。37℃条件下取180 g 离心 5 min，弃上清液，再加入 PBS 2 ml，均匀混合后取180 g 离心 5 min，弃去上清液。加入 1% 多聚甲醛 0.5 ml，均匀混合，在1～4 ℃ 保存，待检测。FACSCalibur 流式细胞仪的开机、关机等操作严格按照说明书进行。开机后启动 FACSComp 软件，标准荧光微球(calibration beads)校正仪器后，以 CellQuest Pro数据获取分析软件获取数据。每管检测10 000 个细胞，采用 CD45 / SSC 设门，分析白血病细胞群中 ICAM-1 阳性表达水平。③对照组：分别取正常骨髓淋巴细胞、粒细胞及单核细胞检测的 ICAM-1 表达水平。

1.2.2 判断标准 根据显微镜下观察到的棕黄色阳性细胞数进行判断，阴性(-):未观察到棕黄色阳性细胞；出现棕黄色阳性细胞本研究均定义为阳性。

1.3 统计学处理

采用SPSS20.0统计软件包对数据进行统计分析。ICAM-1(CD54)表达采用百分数表示，应用描述性统计方法分析。患儿和正常儿童血液中ICAM-1(CD54)表达水平的比较采用列联表资料χ2检验。

2 结果

2.1 ICAM-1(CD54)在患儿肿瘤组织中的表达

肝母细胞瘤ICAM-1检出100.0%(2/2)，其他检出ICAM-1的肿瘤有淋巴瘤、横纹肌肉瘤、神经母细胞瘤、尤文氏肉瘤，而肾母细胞瘤和原始神经外胚层肿瘤未检出ICAM-1。急性淋巴细胞白血病和急性髓系白血病检出率分别为50.0%(10/20)和53.3%(16/30)。见表1。

表1 儿童肿瘤组织中ICAM-1(CD54)的表达水平

2.2 白血病患儿和正常儿童ICAM-1表达的比较

ALL 患儿骨髓细胞的 ICAM-1 阳性表达率为50.0%(10/20)，与对照组骨髓中淋巴细胞上 ICAM-1 阳性表达率(65.0%)比较无显著差异，χ2=0.921，P=0.337。AML ( M1、M2 和 M3) 患儿骨髓细胞的 ICAM-1 阳性表达率为66.7% (12/18)，显著高于对照组骨髓中粒细胞上 ICAM-1 的阳性表达率(10.0%)(χ2=15.292，P=0.000);AML ( M4、M5) 患儿骨髓细胞的 ICAM-1 阳性表达率为 33.3%(4/12)，显著低于正常对照组骨髓中单核细胞上 ICAM-1 的阳性表达率(75.0%)(χ2=5.398，P=0.020)。

3 讨论

细胞间黏附分子(ICAM-1)属细胞黏附分子免疫球蛋白超家族[1]，是重要的炎性细胞因子，在炎症发生与发展中起着重要作用。当组织发生炎症反应时，内皮细胞受侵袭时其表面的ICAM-1经活化后可与白细胞表面的αLβ2及巨噬细胞表面的αMβ2相结合，使白细胞固着于炎症部位的脉管内皮，进而分泌水解酶而穿出脉管壁，促使病变的扩散。目前ICAM-1在肿瘤细胞的侵袭、转移及机体抗免疫功能对抗肿瘤的作用中已引起相关领域的广泛重视。研究认为，儿童白血病患者中ICAM-1表达发生异常改变，与白血病的发生、发展及预后情况有密切联系。ICAM-1的表达异常通过细胞毒性T细胞、NK杀伤细胞作用，ICAM-1依赖的主要组织相容性复合体类抗原免疫识别的影响而发挥作用。

机体在抗肿瘤免疫中起主要作用的是细胞免疫，ICAM-1与其配体抗淋巴细胞功能相关抗原-1( LFA-1) 结合后，主要通过激活 T 细胞、促使B淋巴细胞的分化、增强CIK细胞的肿瘤杀伤作用。CIK 细胞能同时表达CD3+和CD56+膜蛋白分子，具有T淋巴细胞强大的抗瘤活性和NK细胞的非MHC限制性杀瘤特点，杀伤活性可以达到 84.7%，比NK、LAK 细胞抗肿瘤作用更强[2]。CIK细胞作用机理是通过不同的机制识别肿瘤细胞，释放颗粒酶/穿孔素等毒性颗粒，导致肿瘤细胞裂解[3]。CIK细胞在培养过程中表达FasL(Ⅱ型跨膜糖蛋白)，通过与肿瘤细胞膜表达的Fas(Ⅰ型跨膜糖蛋白)结合，诱导肿瘤细胞凋亡。体外培养的CIK细胞可以分泌多种细胞因子，如IFN-γ、TNF-α、IL-2等，不仅对肿瘤细胞有直接抑制作用，还可通过调节机体免疫系统反应性间接杀伤肿瘤细胞[4]。

肿瘤细胞上 ICAM-1 表达数量决定了其对CIK 细胞的杀伤是否敏感。本次研究显示，ICAM-1 在AML 骨髓细胞上的表达与对照组比较差异明显;在 M1、M2和 M3 型AML 骨髓细胞上表达高于对照组，而 M4 和 M5 型 AML 骨髓细胞上表达显著低于对照组。这与熊稀霖等[2]的研究结果基本一致，M1、M2和 M3 型AML对CIK细胞抗肿瘤作用效果明显。国外研究认为，CIK 细胞的细胞毒活性可被抗 LFA-1 或 ICAM-1 的单克隆抗体所阻滞，这进一步提示细胞表面黏附分子ICAM-1在 CIK 细胞识别肿瘤过程中起关键作用[2]。

也有研究显示[5]，ICAM-1与LFA-1和Mac-1结合可以抑制细胞毒性T细胞和自然杀伤细胞的激活与信号的传递，使细胞毒性T细胞、自然杀伤细胞和巨噬细胞杀伤肿瘤细胞的活性降低，导致肿瘤细胞逃避机体的细胞免疫监视。同时，ICAM-1过度活化可产生大量的sICAM-1进入血液，通过对ICAM-1依赖的主要组织相容性复合体类抗原免疫识别竞争性抑制作用，使肿瘤细胞躲避机体的免疫监视，发生肿瘤的侵袭和转移。表达 ICAM-1 的肿瘤细胞与淋巴细胞的黏附性增强，随着淋巴细胞移动，引起肿瘤细胞的扩散和转移。研究发现[6-7]，大肠癌、肺癌细胞表面ICAM-l的过度表达与淋巴结转移密切相关。胃癌细胞表面高表达ICAM-1分子，其产生的sICAM-l可促进癌细胞的血源性转移。

总之，儿童肿瘤细胞ICAM-1分子的表达与CIK细胞免疫杀伤肿瘤细胞有关，高表达 ICAM-1分子的肿瘤细胞易受到CIK 细胞抗肿瘤作用。患儿肿瘤细胞ICAM-1分子高表达也可能发生肿瘤远处转移。参考儿童肿瘤ICAM-1的水平，可对病情进行合理地判断，选择适宜的免疫治疗方案。高表达ICAM-1的肿瘤患儿应考虑积极使用 CIK 细胞免疫治疗[8]。

[1] 张 洁,陈俊杰,陈成水,等.STAT1和ICAM-1在非小细胞肺癌中的表达及其临床意义〔J〕.中国病理生理杂志,2012,28(8):1378.

[2] 熊稀霖,黎 阳,王 林,等.儿童肿瘤及急性白血病中 ICAM-1(CD54)的表达及在CIK 细胞免疫治疗中的临床意义〔J〕.中国实验血液学杂志,2012,20(2):282.

[3] Introna M，Pievani A，Borleri G，et al． Feasibility and safety of adoptive immunotherapy with CIK cells after cord blood transplantation〔J〕.Biol Blood Marrow Transplant，2010,16 (11):1603.

[4] Helms MW，Prescher JA，Cao YA，et al. IL-12 enhances efficacy and shortens enrichment time in cytokine-induced killer cell immunotherapy〔J〕.Cancer Immunol Immunother，2010,59 (9):1325.

[5] Li H,Ge C,Zhao F,et al.Hypoxia-inducible factor-1 alpha-activated angiopoiet n-like protein 4 contributes to tumor metastasis via vascular cell adhesion molecule-1/integrin β1 signaling in human hepatocellular caicinoma〔J〕.Hepatology,2011,4(3):910.

[6] Hayes SH,Seigel GM.Immunoreactivity of ICAM-1 in human tumors,metastases and nomal tussues〔J〕.Int J Clin Exp Pathol,2009,2(6):553.

[7] 宋兰英,闫文生,张进华,等.黏附分子CD54、CD44V6在肺癌转移中的作用〔J〕.实用癌症杂志,2003,18(1):54.

[8] Linn YC，Niam M，Chu S，et al． The anti-tumour activity of allogeneic cytokine-induced killer cells in patients who relapse after allogeneic transplant for haematological malignancies〔J〕.Bone Marrow Transplant，2012，47(7):957.