抗冻蛋白及其抗冻机理研究进展

姚 佳 ，刘显庆 ，单旭东 ，熊华彰 ，彭大才 ，张 明

（1.四川省雅安市农业局畜牧发展中心，四川 雅安 625000；2.四川农业大学动物科技学院，四川 雅安 625014）

抗冻蛋白（AFP）最早是在昆虫当中发现的，1964年Ramsay在黄粉甲幼虫中发现一种冰点低于熔点的物质，1968年Grimstone通过实验证明这种物质是蛋白质。鱼类抗冻蛋白是1969年Devries在南极Mcmurdo海峡一种叫做 Nototheneniid（Trematomas Borchgrevinki）的极地鱼体内发现的，这类抗冻蛋白也成为迄今为止被广泛研究的一类抗冻蛋白。

1 抗冻蛋白的分类

抗冻蛋白存在于不同的生物体内，据此可以将抗冻蛋白分为四类：鱼类抗冻蛋白、植物抗冻蛋白、昆虫抗冻蛋白和细菌抗冻蛋白。已经发现的鱼类抗冻蛋白有5种，这5种抗冻蛋白不仅在结构、功能上存在差异，而且与冰晶作用的方式也不尽相同。植物抗冻蛋白的研究起步较晚，已经从几十种植物当中发现了抗冻蛋白，但分离纯化的很少。昆虫抗冻蛋白分离纯化出了几种，它们的抗冻活性比鱼类抗冻蛋白的活性更高，但纯化后的活性有所降低。关于细菌抗冻蛋白的研究相对较少。表1中所示的是几种不同抗冻蛋白的分子量、蛋白结构等基本特征。

2 抗冻蛋白的特性

2.1 多样性 现在已经在鱼类、昆虫、植物甚至细菌中发现了抗冻蛋白，这些不同生物间的抗冻蛋白从序列和结构上存在根本的差异，甚至相同科不同种属间的抗冻蛋白也存在差异（见表1）。Jia和Feeney认为抗冻蛋白的这种多样性可能与其进化有关，不同的AFP由不同的蛋白质祖先进化而来。

表1 不同种类抗冻蛋白的基本特征

2.2 热滞活性 AFP能特异地吸附于冰晶表面，阻止冰晶生长，非依数性地降低溶液冰点，但不影响溶液的熔点，导致熔点与冰点之间出现差异。冰点和熔点的差值称为热滞值，这一现象称为AFP的热滞活性（THA），这是AFP的一个重要特性。由于所有抗冻蛋白都具备热滞活性，因此抗冻蛋白也被称为热滞蛋白（THP），但不同抗冻蛋白的热滞值均有所不同。影响热滞活性的因素主要有AFP浓度、肽链长度和一些小分子量溶质。AFP浓度越大，热滞活性越强；高分子的肽比低分子的肽热滞活性更强；一些小分子量的溶质如柠檬酸钠、甘油和山梨醇能显著阻止冰核形成，可提高热滞活性。

2.3 重结晶抑制作用 重结晶是指在已形成的晶体颗粒之间进行生长重分配，有的增大，有的减小；大的愈大，小的愈小。在低温和超低温冷冻过程中，重结晶多发生在温度波动时，形成的大冰晶对细胞的损害是致命的。AFP抑制重结晶的特性是它与冰作用的结果。一般AFP抑制重结晶的作用在极低浓度下（＜0.1μg/mL）就可以发挥作用，形成的晶粒体积小且均匀，对细胞和组织的损害也较小。

2.4 改变冰的生长习惯 AFP降低溶液冰点、产生热滞活性、抑制重结晶的特性是它与冰作用的结果。除此之外，AFP还能改变冰的生长习惯。通常情况下，冰是沿平行于基面的方向（a轴）生长，很少有沿晶格表面方向（c轴）生长的。而在加入AFP的溶液中，冰的这种生长习惯发生了改变，冰核逐渐沿c轴方向以针形、纤维状生长，最终形成对称的双六面体金字塔形冰晶，而不是能对细胞和组织产生较大伤害的树枝状冰晶。见图1。由于抗冻蛋白具有以上影响冰的形状及生长的特性，因此也被称为“冰结构蛋白”。

图1 冰晶生长方向示意图

2.5 抗冻蛋白与细胞膜的作用 Rubinsky发现鱼类抗冻蛋白具有在低温下保护细胞膜的功能。但其作用机制尚不十分清楚。当然某些情况下抗冻蛋白也是一种膜毒害剂，如Hincha等研究发现，AFGP和AFPs在植物冷冻过程中实际破坏了类囊体，通常认为可能是AFP进入脂双层，破坏其结构引起渗漏的原因；Melanie等认为产生这种毒害作用的原因可能是转移到植物中的AFP基因的表达发挥了细胞膜低温保护作用，从而降低了细胞对冷的敏感性。

3 抗冻蛋白的作用机制

3.1 吸附抑制学说 吸附抑制学说最早由Raymond和Devries在1977年提出，他们认为抗冻蛋白吸附在冰晶表面通过Kelin效应抑制其生长。吸附抑制学说还认为抗冻蛋白浓度越高则抗冻效果越好，但有时低浓度的抗冻蛋白反而能起到更好的效果；吸附抑制学说还认为抗冻蛋白的抑制重结晶作用对保护大体积细胞（如卵细胞）有利，但其实抗冻蛋白对小体积细胞也能起到保护作用；另外，吸附抑制学说忽略了抗冻蛋白与细胞膜的相互作用、抗冻蛋白之间以及抗冻蛋白和冰晶复合体之间的团聚作用等因素。

3.2 “偶极子-偶极子”假说 该假说由Yang等在1988年提出，他认为AFPs具有显著平行于其螺旋轴亲水基团和疏水基团的偶极子。

3.3 氢原子结合模型 氢原子结合模型认为AFP结构中的氢原子与冰晶上的氧原子匹配并结合，具有很高的冰结合专一性，而其自身的氨基酸组成和螺旋结构有利于提高结合的稳定性。这个理论适合于AFGP和AFPⅢ等。如AFGP的左手螺旋结构将具有双亲特性的双糖暴露于溶液当中，其中亲水的一面与生长的冰面结合，而疏水的一面则抑制冰晶的生长。

3.4 刚体能量学说 刚体能量学说是把AFP视为小粒子，根据表面能最小原理以及“AFP-冰”与“AFP-水”界面之间的表面能差异，AFP能强烈吸附在冰晶表面。当然除此之外，AFP必须与冰晶相匹配，否则水分子就会扩散至界面，随着冰晶的生长使蛋白向前推进。反之，只有当水分子足够多到吞没AFP后，才能形成新的冰晶。

3.5 冰核抑制学说 冰核是形成冰晶的基础，没有冰核的存在，冰晶就不可能生长。冰核抑制学说是近年来对抗冻蛋白作用机制的一种新的见解和补充。2003年，Ning Du等通过实验具体阐述了这种作用机制，第一次发现抗冻蛋白可以通过吸附在灰尘和冰核的表面，减少它们之间的联合来抑制新的冰核形成。

4 应有与展望

4.1 应用

4.1.1 在食品工业上的应用。在冷冻肉类、蔬菜以及冰淇淋制作上，抗冻蛋白抑制冰晶生长的特性可以减少食品营养损失，保持食物口感好，维持食品原有状态等。

4.1.2 在农作物抗寒上的应用。利用转基因技术把异源抗冻蛋白的基因转移到不耐寒作物上，可以增强作物的耐寒能力，还可以改善作物在收获后的储藏加工特性。

4.1.3 在医学上的应用。在器官组织的低温保存中应用抗冻蛋白，能够尽量减少低温对器官组织的破坏；抗冻蛋白应用于冷冻手术，可以保护需要的组织不受破坏。

4.1.4 在卵母细胞、胚胎、精液冷冻中的作用。Rubinsky首先发现AFP具有在低温下保护哺乳动物卵母细胞的作用，他将牛卵母细胞分别用AFPⅠ、AFPⅡ、AFPⅢ处理，结果发现卵膜的完好程度、体外成熟率、可受精能力均较未用抗冻蛋白处理的对照组有明显提高。另外，抗冻蛋白还成功应用于牛羊胚胎的冷冻。抗冻蛋白在对卵母细胞、胚胎、精液进行冷冻保存时主要是通过添加到其他抗冻保护剂中来发挥作用的，最终改善冷冻质量和解冻后的活力、受胎率等。

4.2 展望 Solomon等将AFPⅠ基因导入大肠杆菌中，得到了高水平表达，说明可以用基因工程的方法规模化生产AFP。直接将抗冻蛋白的基因整合到动植物基因组中使之稳定表达，进而产生有活性的产物，同样有很多成功的例子。但是对胚胎、精液等的冷冻保存仍存在一些问题，需要进一步从原理上解决。如果抗冻蛋白与细胞膜的作用一旦了解清楚，可能会成为解决胚胎、精液等冷冻保存的一个突破。对昆虫、细菌的抗冻蛋白研究起步较晚，尤其是昆虫的抗冻蛋白具有比鱼类更为有效的抗冻效果，但对它们的研究还需深入。此外，通过转基因技术生产耐寒的动植物新品种（系）也是一个值得挑战的方向。

[1]Devries A L，Wohlschlao D E.Freezing resistance in some Antarctic fishes[J].Science，1969，163：1074-1075.

[2]彭淑红，姚鹏程，等.抗冻蛋白的特性和作用机制[J].生理科学进展，2003，34（3）：238-240.

[3]Jia Z C，Devis P L.Antifreeze protein:an unusual recepoter ligand interaction[J].Trends Bio Sci，2002，27：101-106.

[4]Yeh Y，Feeney RE.Antifreeze proteins:structure and mechanisms of function[J].Chem.Rev，1996，96：601-617.

[5]Horwath K L，Easton C M，et al.Tracking the profile of a specific antifreeze protein and its contribution to the thermal hysteresis activity in cold hardy insects[J].Eur.J.Entomol，1996，93：419-423.

[6]周 涛，王海洪，等.鱼类抗冻蛋白结构、功能的研究进展[J].宁波大学学报，1997，10（3）：29-35.