16SrDNA序列技术分析鉴定颗粒污泥中的微生物

宋文哲，陈 竹，陈元彩 ，胡勇有

(1.华南理工大学制浆造纸国家重点实验室，广东广州510640;2.华南理工大学环境科学与工程学院，广东广州510006)

五氯酚(PCP)是具有致畸、致癌、致突变作用的难生物降解的异型生物质，作为杀菌剂、防腐剂大量使用，在皮革、纺织、造纸等废水中广泛存在.微好氧颗粒污泥技术将厌氧和好氧在时间和空间上结合起来，使好氧氧化和厌氧还原同时发生，既节省空间，又可以缩短操作周期，是一种新型的废水处理技术［1］.

颗粒污泥内部的微生物生态特征和颗粒污泥对水污染物的处理效率直接相关，全面了解降解五氯酚的微好氧颗粒污泥中微生物种类、数量及其动态性，认识细菌群落的稳定性和功能性等特征具有重要作用［2－3］.传统的微生物法用于环境生物学研究时环境中只有不超过10%的微生物可以培养［4］.16S rDNA 为细胞所共有;其功能同源且最为古老;既含有保守序列又含可变序列;分子大小适合操作;它的序列变化与进化距离相适应［5］，16S rRNA 序列分析作为微生物分类系统的主要依据也得到了广泛认同［6－9］.

16S rDNA 技术应用于PCP 的研究在国内外已多见报道，TARTAKOVSKY 等［10］通过16S rDNA 技术分析和鉴定了2 种降解PCP 的菌;曾光明等［11］通过16S rDNA 分析微生物群落组成的变化评价和预测堆肥成熟和PCP 污染的指标;李向丽等［12］应用16S rRNA 基因克隆文库方法对PCP 厌氧生物降解体系中细菌群落的组成和相对丰度进行了研究，进一步拓宽了对PCP 降解微生物多样性的认识.然而通过比较DEEG 条带强度的相对变化从而定量研究PCP 对污泥中细菌群落动态变化未见报道，本研究通过定量分析污泥中各种菌的相对数量变化，为解析微氧颗粒污泥的微生物群落结构与群落动态，从而发现降解PCP 的优势菌群，为进一步探索微氧颗粒污泥中微生物降解五氯酚的机理提供依据.

1 材料和方法

1.1 污泥样品的采集

污泥样品培养参考文献［2］，分别取自微好氧颗粒污泥反应器，包括接种污泥、微好氧颗粒污泥以及用PCP 驯化后的成熟颗粒污泥.其中微好氧颗粒污泥取自溶解氧低于0.6 mg/L 的情况下在微好氧颗粒污泥发生器中培养60 d 的污泥，PCP 驯化的成熟颗粒污泥取自用PCP 从0.2 mg/L 增加到6 mg/L的废水对微好氧颗粒污泥驯化培养120 d 的污泥.每次取样约500 mg，于5 000 r/min 离心5 min 后弃去上清液备用.

1.2 颗粒污泥总DNA 的提取及PCR 扩增

颗粒污泥总DNA 提取参考文献［2］，真细菌PCR 扩增对象为真细菌16S rDNA V3 可变区，其引物为:上游引物为:5’－ CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG GCC TAC GGG AGG CAG CAG－3’;下游引物为:5’－ ATT ACC GCG GCT GCT GG－3’.古细菌PCR 扩增对象为古细菌16S rDNA V3 可变区，其引物为:上游引物为:5’－ CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG GTC CAG GCC CTA CGG GG－3’;下游引物为:5’－ TTA CCG CGG CTG CTG GCA C－3’.PCR 的反应程序:94 ℃预变性4 min，94 ℃变性0.5 min，52 ℃退火1 min，72 ℃延伸0.5 min，30个循环，最后72 ℃延伸7 min.PCR 反应体系中基因组0.5 μL，10 × Buffer(含2.0 mmol/L MgCl2)5.0 μL，dNTP(10 mmol/L)1.0 μL，上游引物(10 μmol/L)1.0 μL，下游引物(10 μmol/L)1.0 μL，Taq 酶(5 U/μL)0.25 μL，ddH2O41.25 μL.

1.3 变性梯度凝胶电泳及测序构建系统发育树

变性梯度凝胶电泳及测序构建系统发育树参考文献［2］，扩增过程中真细菌的引物为:上游引物:5’－ACT CCT ACG GGA GGC AGC AG－3’;下游引物:5’－ATT ACC GCG GCT GCT GG－3’. 古细菌的引物为:上游引物:5’－ TC CAG GCC CTA CGG GG－3’;下游引物:5’－ TTA CCG CGG CTG CTG GCA C－3’.

2 结果与讨论

2.1 颗粒污泥中细菌种群比对及其系统进化树

将3 种颗粒污泥样品中真细菌和古细菌DGGE图谱的主要条带进行切胶回收并测序，分别得到6个和5个可用序列进行序列同源性分析. 采用邻接法构建系统进化树. 对进化树树形的稳定性进行检测，输出60%以上的数值(图1、图2).

图1 真细菌进化树的BOOTSTRAP 检测值Figure 1 BOOTSTRAP check of phylogenetic tree of Eubacteria

从真细菌进化树可以看出，6个测序的条带主要可分为4 大类群:Band 4、19、25 之间的同源性较高，可归为GroupⅠ;Band 16 可归为GroupⅡ;Band 17 可归为GroupⅢ;Band 37 可归为GroupⅣ.

图2 古细菌进化树的BOOTSTRAP 检测值Figure 2 BOOTSTRAP check of phylogenetic tree of Archaea

从测序的条带进化树看出，古细菌可分为3 大类群:Band 26、27、28 之间的同源性较高，可归为GroupⅠ.Band 9 可归为GroupⅡ;Band 21 可归为GroupⅢ.

2.2 颗粒污泥微生物分析

DGGE 条带的强弱反映了相对的数量，通过BandScan 软件对3 种不同颗粒污泥中的真细菌和古细菌DGGE 图像进行分析，得到真细菌和古细菌主要条带的强度图(图3、图4).

利用Shannon 多样性指数计算公式得出真细菌的在接种污泥、微好氧颗粒污泥、PCP 驯化的微好氧颗粒污泥的指数分别为2.09、2.61、2.55，结合真细菌DGGE 条带强度图发现接种污泥在微好氧条件下出现新的条带如Band4、16、25、37;但同时还有一些真细菌不适应微好氧条件，条带消亡如Band19，说明它代表的细菌不能适应微好氧的环境而逐渐被淘汰.Band16、25 不适应PCP 驯化而消亡从而使多样性指数下降，说明这些条带代表的细菌能够很好的适应微氧的条件，但是它们不能耐受PCP 的毒性，在PCP 的毒性环境中不能生存. Band4、37 很可能是降解PCP 的优势菌种，Band4 与鞘氨醇单胞菌同源性很高，BEAULIEU 等［13］发现PCP 污染的土壤中含有的微生物与鞘氨醇单胞菌有关.Band37 与不可培养的放线菌同源性很高，放线菌可以生长在活性污泥中，形成稠的絮状泡沫，而且它们能够降解大量不同种类的有机化合物，对有机物的矿化有非常重要的作用［14］. Band 17 其在培养过程中一直存在，它们可能对微生物的物质和能量代谢起着非常重要的作用.

图3 真细菌DGGE 条带的强度图Figure 3 Intensities for Eubacteria in DGGE band

图4 古细菌DGGE 条带强度图Figure 4 Intensities for Archaea in DGGE band

对古细菌Shannon 多样性指数计算得出接种污泥2.53、微好氧颗粒污泥1.85、PCP 驯化微好氧颗粒污泥1.84，说明部分古细菌不能适应微好氧环境而消亡如Band26、27，但它们在PCP 驯化的微氧颗粒污泥中则有所增加，很可能是降解PCP 的有效菌种.微好氧颗粒污泥和PCP 驯化颗粒污泥多样性变化不大，如Band 21 很可能是降解PCP 的优势菌群，它与不可培养的产甲烷古菌具有高达100%的同源性，任艳红等［15］曾在降解五氯酚的厌氧反应器中分离测序得到产甲烷菌，对PCP 的降解具有非常重要的作用;吴唯民等［16］也对具有还原脱氯性能的颗粒污泥内微生物进行了鉴定，主要有利用乙酸盐的产甲烷菌、利用氢的产甲烷菌.DGGE 条带强度图表明Band 9 是PCP 驯化后颗粒污泥中新增的特异性条带，这个条带代表的细菌与鞘氨醇单胞菌同源性很高，可以有效降解五氯酚.Band 28 一直存在但呈现不断下降的趋势，说明这一类古菌不能适应微氧的环境或者是PCP 的毒性环境，而逐渐减少.

3 结论

(1)构建了真细菌和古细菌的系统进化树，真细菌测序的条带可分为4 大类群，古细菌测序的条带可分为3 大类群.

(2)通过比较不同菌的相对数量变化发现经过五氯酚驯化后产生了一系列对五氯酚降解有利的优势细菌和古菌，例如Sphingomonas sp.、Actinobacterium、Methanogenic bacterium 以及其它一些Uncultured anaerobic bacterium，它们对五氯酚的降解具有非常重要的作用，是降解PCP 的优势菌种.

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