影响显微摄影清晰度的关键操作技术

王小平，张 凌，王亚平，许佳捷

第二军医大学:1基础部数理教研室;2训练部教育技术中心，上海 200433

显微摄影是生物、临床医学普遍开设的基础性实验。实验一般采用黑白胶卷或相纸感光、显影和定影等方法，将显微镜视野中所观察的样本真实地记录下来，旨在使学生掌握显微摄影的基本原理和操作技术。然而，受冲洗时间等条件的限制，有关屈光度、聚焦、聚光镜孔径光阑等的操作与影像清晰度之间的关系，以及影像清晰度缺乏客观、量化的指标或参数，难以揭示或表述显微摄影操作流程与影像清晰度的内在关系，造成学生拍摄的照片普遍质量不高。

该文结合文献研读和摄影实践，引用镜头评价MFT曲线中的对比度(锐度)和分辨率等概念和定义，用以直观和量化图像清晰度的概念，并对显微摄影操作中的关键步骤和显微照片清晰度的关系作进一步探讨，以期获得一些对医学显微摄影人科研和教学有益的结论。

1 图像(影像)清晰度的定义

一般认为，清晰度是影像边缘的锐利程度，主要包括像素、亮度(在黑白图像中等同于灰度)、对比度等［1］。也有人把清晰度定义为影像系统对画面细部还原能力的综合评价，包括解像力、颗粒度、反差和影调再现等方面［2］。国外的一些摄影教程则认为，影像清晰度是人的视觉对清晰程度所做出的主观判断，其中还必须包括影像反差以及实际呈现精微细节的多少［3］。

镜头的调制传递函数(MTF)曲线是对镜头解像力的一个定量描述，是镜头成像质量的一个重要指标。用于镜头解像力的测试标版如图1所示。这个黑白条纹包含了描述影像清晰度的两个基本要素:锐度(acutance)是指黑白色调边界的锋利或锐利程度，即黑白边界处的对比度，是描述边界处影像信息过渡的快慢，高锐度导致信息的迅速过渡从而使得边界清晰可见(如图2所示):左图锐度高于右图;分辨率(resolution)描述的是对空间细节分辨的能力，即单位长度包含的黑白条纹数目，如果能把相邻非常近的线条分开，我们就说这个相机或镜头的分辨率高，图3左边分辨率要高于右边。分辨率常用“空间频率”(简称频率)来定量描述，图1中空间频率是变化的，从左往右，黑白条纹宽度逐渐变窄，间隔逐渐变小;空间频率逐渐升高。左边是低频，右边是高频。

图1 镜头解像力的测试标版［4］

图2 高低锐度对照图［4］

图3 高低分辨率示意图［4］

MTF值代表的是在一定的条纹空间频率下对比度的复制率。在MTF曲线中，横轴是空间频率，纵轴是对比度的“复制率”，即MTF值。比如:在某个给定的频率位置，原物的对比度是10，如果镜头成像的对比度是10，那么MTF=1(或100%);如果镜头成像的对比度是5，那么 MTF=0.5(或50%)。理想镜头的MTF曲线在低频端的MTF值接近于1，随着频率增加，MTF值逐渐降低，因为衍射现象的影响开始变得重要;在高频端，衍射的影响强烈到影像无法解析的程度，MFT值趋近于0，即黑白条纹无法分辨，分辨率变成0。除镜头本身的制作质量，MTF曲线还依赖于光圈值和焦距。

显然，镜头MTF曲线中描述清晰度的两个参数也可用于显微照片质量的评价和清晰度的定义，锐度和分辨率都可以量化，并且形象直观，初学者使用测试标版进行拍摄练习，可以很好地感知清晰度的概念以及关键操作对清晰度的影响。

2 照明系统的调节

“用光是摄影的语言”［5］，显微摄影因其实际视场面积的缘故，样品照明是决定显微照片质量的重要参数。1893年德国蔡司的柯勒(August Kohler)研发了一种完善的透射照明方法，这一方法能使样品获得均匀、充分明亮的照明，防止杂散光对成像的影响，并使样品受热最小而成为一种最佳照明的方法。因此，显微摄影的首要工作就是照明光路系统的调整，而按照柯勒照明系统的要求和步骤来进行，就是关键之所在［6］。

2.1 柯勒照明法［6］

图4 库勒照明系统的原理图

图4是库勒照明系统的原理图。光源的灯丝1经聚光镜2及可变视场光阑3后，灯丝像a第一次落在聚光镜孔径光阑4的平面处，此处也是聚光镜5的前焦平面，而光源发光体的所有光点汇集起来，便在聚光镜的孔径光阑上形成了发光体的完整像。从光学系统的原理来看，就好像把光源的发光体正好摆在聚光镜5下方的前焦平面上，出射的照明光，就是发光体上所有发光点从各个方位上汇集起来的一束平行光，它穿越样品使样品上获得充分的照明，因而从物镜7成像的视域中看不到灯丝的像，即不出现灯丝的条纹。包含了光源灯丝像与孔径光阑像的平行照明光束，则由物镜7汇聚成像于物镜的后焦平面处，即出瞳8(只要把目镜从目镜筒上拔出观察，就可以看到这两个像)。此外，照明的热焦点不在被检样品的平面处，即使长时间的照明，也不致损伤被检样品。

2.2 视场光阑调节［7］

视场光阑由10片或更多的叶片组成一个接近于圆形的多边形通光孔状屏障，从显微镜的样品视域6中可以看到视场光阑经聚光镜所成的多边形的像。视场光阑3位于显微镜的底座上，其位置处在聚光镜5的二倍焦距以外。聚光镜的托架上通常都设有聚光镜高低位置的调节机构，调节聚光镜的高低位置就可把视场光阑成像于样品平面上，在样品调焦清晰的同时也可看到清晰的视场光阑像。

视场光阑可调控投射到聚光镜的照明光束直径的大小;控制杂散光在成像光路系统中的影响，特别是免除杂散光对于显微照相系统的干扰，使显微照相的底片不至于蒙上一层灰雾;视场光阑对成像反差的影响则较为次要，不影响显微镜的分辨率，也不影响物镜或聚光镜的数值孔径。

2.3 聚光镜系统调节［7］

聚光镜系统可由聚光镜本体、前端透镜和聚光镜孔径光阑4组成，该系统总是装于显微镜载物台的下方介于视场光阑与样品之间，故也叫台下聚光镜。聚光镜孔径光阑也是由10片或更多叶片组成的一个接近于圆形的多边形通光孔状屏障，调节聚光镜孔径光阑:可以影响显微镜作观察时的分辨率;直接控制显微照相底片上的反差;可用来调节聚光镜的数值孔径，使与所使用的物镜数值孔径做出适当的配合，以取得最佳或最大分辨率。

聚光镜的数值孔径与物镜的数值孔径对于显微镜分辨率的影响，具有同等的重要性。不同放大倍数的物镜其数值孔径不同，因此，只有改变聚光镜的数值孔径来做出适当配合以达到最佳分辨率。理论上要求两者的数值孔径应该相等(因显微样品的反差通常较低)，而实践证明，只要把孔径光阑像的大小调到等于物镜出射光瞳直径的2/3～4/5，即66%～80%时(如图5所示)，才可以达到最佳的分辨率与最佳的反差。

图5 聚光镜孔径光阑的调节

3 屈光度调节和调焦

在光学成像系统中，只有当成像平面与物体平面共轭时，即图像处于聚焦状态，图像最清晰。此时称成像平面为聚焦平面。离聚焦平面越远，图像越不清晰。

3.1 屈光度调节

图6 屈光度的调节

屈光度调节又称视度调节，是考虑使用者在不方便佩带眼镜观察时个人眼睛的视力差异，而设置的具有屈光度调节装置—侧视目镜取景器，其原理如图6所示:筒状侧视目镜取景器由数片透镜和分划板(玻璃屏)组成。近眼端为屈光度调节环，可左右转动用于变换透镜间距，改变焦点距离。调节环旋转调节的最大范围为±5屈光度(1屈光度相当于眼镜的100度)。经过调节，近视或远视眼在500度以内均可裸视取景对焦。

侧视目镜取景器内的分划板上刻有双十字线，分划板本身在光路中的位置是固定的，并且与照相感光底片为一对共轭焦平面，即:若在分划板上成像清晰，则在感光片处也必成清晰像。

调节时，左右转动屈光度调节环，使侧视目镜取景器镜筒的前端伸缩，改变焦距，直至清晰地分辨出双十字线为止。双十字线校准后，要保持不变，以防焦距改变。当十字被调节成双线时，聚焦的像点能清晰地投射在胶片面上;如果十字线成单线，即使分划板上影像清晰，到达感光片上光线并非聚焦，像点并不落在胶片面上，底片影像模糊不清。当改变拍摄者或左右眼调换使用时，均需重新进行屈光度的调节。

3.2 聚焦

聚焦是通过显微镜的粗、细调焦螺旋进行的。转动显微镜的粗、细调节螺旋改变物镜前透镜和被检物体的距离，使视场中物体影像的焦点聚于机身的胶片平面上。纵横移动镜台上制片标本，寻找拍摄图像，上下转动调焦螺旋、辨清被摄体的细微结构。由于显微镜景深非常短，调焦要特别细致、准确，底片影像清晰度决定于拍摄前的最终一次准焦。

对比度(锐度)和分辨率有着明确的定义和量化参数，将其作为清晰度的两个主要组成部分之后，可以建立显微摄影操作流程与影像清晰度之间的对应关系，从中可以找出影响显微摄影质量的关键操作，由此可让学生快速掌握显微摄影的关键操作，获得清晰的显微照片。

显微照片的清晰度除了受制于照明方法、视场光阑、聚光镜孔径光阑、屈光度的调节和是否准焦外，还与标本的处理、载玻片和盖玻片的材质、厚度，滤色镜的选取、物镜的质量、自动曝光时间、照片冲印等因素有关，这些因素之间相互关联、相互牵制，其中任何一个环节处理不当都会影响影像的清晰度以及图像的最佳效果。

［1］崔作龙，徐长松.图像清晰度的量化测量探究［J］.实验技术与管理，2012，29(5):49-51

［2］谷小雄.图片的基本要素:清晰度(上)［J］.摄影与摄像，2011，(7):98-101

［3］兰福德 M.高等摄影教程［M］.李之聪，陈晓钟，译.北京:中国摄影出版社，1999:17-19

［4］Cambridge in colour.Sharpness［EB/OL］.http://www.cambridgeincolour.com/tutorials/sharpness.htm，2013-04-01

［5］Hunter F，Biver S，Fuqua P.美国摄影用光教程［M］.刘炳燕，译.北京:人民邮电出版社，2008:1-2

［6］沈彬源.库勒照明系统(Kohler illumination system)的正确调整［EB/OL］.2007-12-16.http://www.bbioo.com/instrument/54-20630-1.html，2013-04-10

［7］沈彬源.正确认识光源的视场光阑与聚光镜系统以及孔径光阑的正确使用［EB/OL］.2007-12-12，http://www.bbioo.com/instrument/54-20603-7.html，2013-04-10