鲜蟾皮外敷促进糖尿病大鼠皮肤溃疡愈合的实验研究*

张晓义 ，唐祝奇 ，刘 春 ，朱晓晖 ，印 彤 ，王粹芳 ，崔世维

（1南通大学附属医院内分泌科，江苏226001；2南通大学实验动物中心）

糖尿病足(diabetic foot,DF)是指糖尿病患者合并神经病变及周围血管病变而导致下肢感染、溃疡形成和(或)深部组织破坏[1]，是患者截肢致残、死亡和日常生活能力丧失的重要原因[2]。近年来发病率明显增加，越来越受到国内外学者的关注[3]。糖尿病足防治的关键是预防[4]，约80%的糖尿病足最初起源是足部溃疡，积极有效地处理足部溃疡可极大地减少糖尿病足的形成和发展。足溃疡的局部处理有多种方法，生物活性敷料覆盖是可选择的方法之一[5-6]。传统医学中有应用蟾皮外敷治疗各种无名肿毒与外伤创口的方法。现代医学研究证明，蟾皮中含吲哚碱、二烯羟酸内酯等生物活性物质[7-8]。本研究对糖尿病大鼠进行皮肤溃疡造模，观察鲜蟾皮外敷增加血管内皮生长因子表达（vascular endothelial growth factor,VEGF）促进溃疡愈合的疗效并探讨作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料 清洁级雄性SD大鼠42只，体重（210±10）g，南通大学实验动物中心提供。实验动物生产许可证号：SCXK(苏)2008-0010,实验动物使用许可证：SYXK（苏）2002-0022。饲养在SPF级屏障环境，饲喂无菌颗粒饲料（苏州双狮实验动物饲料科技有限公司），其中碳水化合物 58.2%，脂肪 3.8%，蛋白质18.3%,自由采食和饮水。

1.2 方法 （1）糖尿病大鼠皮肤溃疡模型建立：大鼠适应性饲养1周，随机选取30只禁食12h（不禁水）。按65mg/kg剂量一次性腹腔注射经稀释的链脲佐菌素，即10g/L，pH4.4，100mg链脲佐菌素溶于10mL柠檬酸-檬酸钠缓冲液（美国Sigma公司原装进口）。自由进水，1周后出现多尿、多饮、体重下降，且随机血糖在16.7mmoL/L以上者为造模成功。造模成功后继续维持饲养，每周2次检测血糖维持在16.7mmol/L以上。于第2周使用盐酸戊巴比妥钠（100mg/Kg）腹腔注射麻醉，将大鼠腰背两侧皮肤脱毛消毒，作长1cm、深达浅筋膜的纵形切口，每日50%冰醋酸涂抹创面一次，持续1周，制备成缺损性皮肤溃疡大鼠模型；创面无菌敷料覆盖，单笼饲养。（2）动物分组及干预：造模成功后的30只大鼠随机分为糖尿病皮肤溃疡造模组（15只）、糖尿病皮肤溃疡治疗组（15只）。正常对照组12只，腹腔一次性注射等体积不含STZ的柠檬酸-檬酸钠缓冲液。治疗组生理盐水清洗溃疡部位后，鲜蟾皮外敷并用医用纱布固定；模型组仅用生理盐水清洗溃疡部位。（3）组织病理学检查：第2、3周末大体观察溃疡创面，切取周围2cm组织，10%甲醛固定，石蜡包埋切片。HE染色，光学显微镜观察组织大体结构。（4）免疫组织化学检查：采用LAB VISION 2D全自动免疫组化染色仪，EnVision二步法染色。所用一抗及ELIVISON试剂盒(PV-9000)和DAB酶底物显色试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司。观察组织中血管内皮生长因子表达情况。采用酶联免疫吸附反应（ELISA）技术测定组织中VEGF含量。

1.3 统计学处理 应用Stata7.0统计软件处理数据。计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较用方差分析，实验前后同组资料比较用配对t检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结 果

2．1 糖尿病大鼠模型建立 糖尿病造模一次成功29只大鼠，二次造模成功1只。大鼠随机血糖高于16.7mmoL/L，活动明显下降，身体消瘦，毛发干枯、竖立，饮水量及尿量明显增多。

2．2 实验大鼠皮肤溃疡形态及组织病理观察 各组在2周形成面积大小相似的溃疡，其中（1）模型组3周溃疡结痂创面缩小；2周表皮细胞有变性改变，细胞结构不清，核浓缩，表皮和表皮下层结构松散；3周表皮有小部分恢复，形态结构与溃疡2周基本相似；（2）治疗组3周溃疡结痂脱落，创面愈合。溃疡3周时大鼠皮肤愈合良好，表皮层结构基本恢复见图1。（3）对照组皮肤表皮层细胞排列整齐，颗粒层清晰可见；真皮层皮肤附件结构、形态良好。

2.3 创面组织VEGF表达与对照组比较 糖尿病大鼠创面组织VEGF含量降低；治疗组VEGF含量2周时增高，但低于正常对照组，3周时表达下降（图2）。

图1 各组大鼠皮肤组织大体病理（100×）

图2 各组大鼠皮肤溃疡组织VEGF的表达（400×）

创面组织中VEGF的ELISA定量分析结果见表1。

表 1 创面组织第2、3周末VEGF的ELISA分析结果（只，±s）

表 1 创面组织第2、3周末VEGF的ELISA分析结果（只，±s）

与对照组比较，*P＜0.05；第 2 周末比较，#P＜0.05

组别 n 第2周末(μg/g) 第3周末(μg/g)对照组 12 48.3±4.2 45.6±3.4模型组 15 15.6±2.2* 10.9±2.7*#治疗组 15 40.7±4.5* 19.5±3.2*#

3 讨 论

随着糖尿病患病率的上升，糖尿病相关的慢性创面越来越受到关注[9]。糖尿病皮肤溃疡是其中较多见的一种，发病率高达15%，且由于机体长期处于慢性高血糖坏境，导致创面无法得到有序而及时的修复。特点为愈合能力低，愈合延迟或不愈合，为临床常见慢性难愈性创面[10-11]。本实验在糖尿病大鼠背部皮肤切开后，持续化学刺激制备溃疡模型，表现为创面正常组织结构破坏、排列紊乱，符合糖尿病慢性创面的组织病理学特征。

临床治疗中改善糖尿病皮肤溃疡局部微环境是治疗关键[12-13]。基础研究提示糖尿病皮肤溃疡难愈与局部组织细胞外基质沉积减少[14-15]，特别是内皮细胞功能降低有关[16-18]。VEGF是参与血管化调控的主要生长因子，可触发一系列修复反应，能有效促进血管内皮细胞增殖及迁移，促进新血管形成。糖尿病难愈创面VEGF不仅呈低水平表达，表达高峰持续时间也缩短，是创面难愈的重要原因之一[19]。本研究结果亦提示此点，遗憾的是未观察微血管密度。

中医有将蟾蜍入药记载，目前蟾皮、蟾酥、干蟾均为国家药典或卫生部颁发的标准收载药材，主要药用活性成分有蟾蜍毒素类、蟾蜍配基类、蟾蜍色胺类等[20-21]。鲜蟾皮内含蟾酥，具有解毒止痛之功效，某些蟾皮因子可促进细胞移行、生存及伤口修复。本研究发现鲜蟾皮外敷可增加溃疡创面VEGF表达水平及持续时间，促进糖尿病大鼠皮肤溃疡愈合，其临床应用效果值得研究。

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