运动延缓高脂膳食诱导大鼠胰岛素抵抗形成的机制

李 蕾， 李之俊， 魏安奎， 胡振东

(1．淮北师范大学 体育学院，安徽淮北235000;2．上海体育科学研究所，上海200030;3．上海体育学院运动科学学院，上海200438)

在医学科研工作者深入研究胰岛素抵抗(IR)发生、发展机理，寻求理想增敏药物靶点的背景下，早期运动干预的独特优势促使运动医学研究者努力探寻其机制。从运动影响胰岛素受体后信号通路的角度探讨其机制是多年的主流方向。研究涉及胰岛素信号通路中关键蛋白表达以及细胞因子表达的层面，但同时非胰岛素依赖的信号途径也日渐引起广泛的关注。本研究选取胰岛素敏感的骨骼肌、肝脏、脂肪3大靶组织，观察脂肪细胞因子脂联素和非胰岛素依赖信号途径关键蛋白AMPK在高脂和运动干预下的变化，进而探讨运动延缓高脂膳食诱导大鼠形成的机制。

1 材料与方法

1．1 材料

1．1．1 实验动物和分组 购入7周龄纯系SD雄性大鼠46只，体重180～200 g，SPF级。随机分为普食对照组(C组)12只、普食运动组(E组)12只、高脂膳食对照组(H组)10只、高脂膳食运动组(HE组)12只。

1．1．2 动物模型的建立和运动干预方案［1］使用普通饲料(蛋白质 26．4%，脂肪 13．5%，碳水化合物60．1%)适应性喂养1周，然后H组和HE组改高脂饲料(蛋白质23．5%，脂肪44．1%，碳水化合物32．4%，提供能量约1 709．5 kJ/100 g)，C组和E组继续普食喂养。同时E组和HE组开始实施无负重游泳训练，参考 T．Ploug等［2］报道的方法:水温(33 ±2)℃，水深50 cm，保证每只大鼠有足够面积持续运动。运动持续时间第1周30 min/d，第2周(30～60)min/d，第3周(60～90)min/d，第4周90 min/d直至实验末。每周5 d，共持续10周。

1．1．3 标本采集运动组末次运动结束48 h，禁食12 h，以10%水合氯醛按(40～45)mg/kg(体重)腹腔内麻醉后，将大鼠仰卧位固定于大鼠手术台上，逐层打开腹腔，于下腔静脉取血6 mL左右，静置后离心取血清，－20℃保存，待测FINS、FBG、血清脂联素。随后剥离肾周、腹膜后及附睾脂肪垫，计为内脏脂肪，迅速投液氮，－80℃冰箱冻存，待测脂肪组织脂联素基因表达。迅速取整肝，取双侧大腿红色股四头肌，迅速投液氮，－80℃冰箱冻存，待测肝脏和骨骼肌AMPKα蛋白表达及磷酸化水平。

1．2 测试指标及方法

1．2．1 空腹血糖(FBG) 美国强生LIFESCAN－稳捷基础型血糖仪。

1．2．2 空腹胰岛素(FINS) 美国LINCO Research公司胰岛素RI－13K放免试剂盒。

1．2．3 胰岛素敏感指数(ISI)、抵抗指数(HOMA－IR)计算 依李光伟公式:ISI=1/(FINS×FBG)(取其自然对数);HOMA－IR=(FINS×FBG)/22．5。

1．2．4 血清脂联素测定 芬兰Thermo公司Wellscan MK3型酶标仪，采用双抗体夹心 ABC－ELISA法，按照试剂盒说明书操作。

1．2．5 大鼠内脏脂肪组织脂联素mRNA实时荧光定量PCR检测 取内脏脂肪组织200 mg，于液氮中迅速研磨至粉末状，每50 mg加入1 mL Trizol充分快速匀浆，经过分相和沉淀，抽提总RNA。琼脂糖凝胶电泳，紫外分光光度计观察条带完整性，测定OD260/OD280比值在1．8 ～2．0。使用 Promega，Madison，WI提供的逆转录试剂盒，取RNA2ug进行逆转录。于GenBank上查找大鼠脂联素和GAPDH的基因序列，Realtime PCR引物由ABI公司PrimerExpress 3．0软件设计，由上海英骏生物技术有限公司合成。引物设计后先用普通PCR进行特异性检测和最佳退火温度摸索，以进行后续的荧光定量PCR。adiponectin的引物序列为:上游5'－GCACGAGGCGAGAAAGGA－3'， 下 游 5'－CCTACGCTGAATGCTGAGTGAT－3'。GAPDH 内参的引物序列为:上游 5'－ACCACAGTCCATGCCATCAC－3'，下游 5'－TCCACCACCCTGTTGCTGTA－3'。

取上述cDNA样品按5倍稀释，依次加入SYBR GREEN 5 μL，上下游引物各1 μL，ddH2O 2．5 μL，总反应体系为10μL，轻弹管底将溶液混合，5 000 r/min短暂离心。反应温度程序50℃ 2 min，95℃ 10 min，接着40个循环(95℃ 15 s，60℃ 1 min)。所有样品用GAPDH作内参。

1．2．6 大鼠股四头肌、肝脏AMPKα蛋白表达及磷酸化水平检测 取肌肉(肝脏)组织块称量0．5 g，粉碎组织块，制备组织匀浆，4℃下以15 000 r/min的速度离心15 min，得上清液分装保存。SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳，Bio－Rad蛋白转移装置转膜后，加入PBST+5%BSA封闭液，在摇床上缓慢摇动，室温封闭60 min。按照1∶2 000比例用PBST稀释液稀释一抗(兔抗大鼠AMPKα单克隆抗体和兔抗大鼠AMPKαThr172磷酸化单克隆抗体)。室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育1 h。参考二抗的说明书，按照1∶3 000比例用Western二抗稀释液PBST稀释辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗。室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育1 h。X线胶片曝光，扫描保存，采用Totallab V2．01图像分析软件对条带灰度进行分析和比较。AMPKα的磷酸化程度以磷酸化AMPKα的条带灰度与总AMPKα条带灰度的比值计算。

1．3 数据处理 所有数据采用SPSS11．5统计软件包建立数据库，以均数±标准差表示，先进行方差齐性检验，再进行独立样本t检验，以P＜0．05为差异显著，P＜0．01为差异非常显著。

2 研究结果

2．1 大鼠FBG、FINS、HOMA-IR、ISI的变化比较(表1)

表1 大鼠FBG、FINS、HOMA-IR、ISI的比较(Mean±SD)Table 1 Comparison of FBG，FINS，HOMA-IR，ISI in Rats

表1提示高脂大鼠IR模型建立成功［1］。

2．2 大鼠血清脂联素检测结果(表2)

表2 大鼠血清脂联素水平的比较(Mean±SD) mmol/LTable 2 Comparison of Serum Adiponectin Level in Rats

2．3 大鼠内脏脂肪组织脂联素mRNA实时荧光定量PCR检测结果(表3)

表3 大鼠内脏脂肪组织脂联素mRNA表达的比较(Mean±SD)Table 3 Comparison of Visceral Fat Tissue Adiponectin mRNA Expression in Rats

由表3可见，H组和C组相比，H组脂肪组织脂联素mRNA表达显著低于C组(P＜0．05)，E组略低于C组，HE组略低于H组，但差异不具有显著性(P＞0．05)。

2．4 大鼠股四头肌AMPKα蛋白表达及磷酸化水平检测结果(图1，表4)

图1 大鼠股四头肌AMPKα蛋白表达及磷酸化水平检测结果Figure 1． Testing Results of AMPKα Protein Expression and Phosphorylation in Rats Quadriceps Muscle

表4 大鼠股四头肌AMPKα磷酸化水平灰度值(Mean±SD)Table 4 AMPKαPhosphorylation Gray Value in Rats Quadriceps Muscle

2．5 大鼠肝脏AMPKα蛋白表达及磷酸化水平检测结果(图2，表5)

图2 大鼠肝脏组织AMPKα蛋白表达及磷酸化水平检测结果Figure 2． Testing Results of AMPKα Protein Expression and Phosphorylation in Rats Liver

表5 大鼠肝脏组织AMPKα磷酸化水平灰度值(Mean±SD)Table 5 AMPKαPhosphorylation Gray Value in Rats Liver

3 讨论

3．1 高脂膳食对大鼠血清脂联素和脂肪组织脂联素mRNA表达的影响 循环脂联素有低分子量三聚体、六聚物和高分子量多聚结构3种形式。正常机体中脂联素处于高水平，范围为(1～17)μg/mL，而其循环水平和基因表达在肥胖和脂代谢紊乱状态下下降［3－4］。在本实验中，未发现高脂膳食对大鼠血清脂联素水平有显著影响。这与许多研究发现高脂组血清脂联素水平低于对照组的结论似乎不吻合。有研究认为，机体胰岛素敏感性增高并非由总脂联素绝对含量决定，而是LMW/HMW比值增高起关键作用［5］。鉴于脂联素结构和功能的复杂性，近来有学者提出要把对脂联素水平的关注从其总体水平转移到不同存在形式与总体水平的比例上。

脂肪组织脂联素表达与脂肪组织功能更为紧密。肥胖者不同部位脂肪组织脂联素含量和分泌亦存在差别。例如:T2DM患者一级亲属皮下脂肪脂联素mRNA表达减少，但血浆脂联素水平与正常组无异［6］;肥胖Zucker大鼠内脏脂肪脂联素mRNA表达减少，而皮下脂肪表达与正常组无差异，且体重减轻后内脏脂肪脂联素mRNA的表达增加［3］。目前，分别对皮下和内脏脂肪脂联素mRNA表达的研究鲜有报道。考虑到内脏脂肪堆积与IR高度相关，因而选择测定内脏脂肪组织脂联素mRNA表达情况。本实验结果显示，H组脂肪组织脂联素mRNA表达显著低于C组，表明内脏脂肪组织脂联素mRNA表达存在肥胖的负反馈抑制，可能参与介导了高脂大鼠IR的形成。这与唐兆生等［7］的研究结果相符。脂肪组织特异性合成脂联素后，大都以内分泌方式释放入血，因此血清含量比较丰富和易于检测。本实验各组间血清脂联素水平无显著差异，推测脂联素的蛋白合成水平并未发生显著变化。这符合mRNA水平和蛋白水平相互偶联但两者并无必然一致趋势的观点。本实验还发现H组血清脂联素水平有略高趋势，这似乎与以往研究报道的观点不大一致。考虑可能与H组大鼠样本较少有关。值得注意的是，查阅国外文献报道发现，脂联素水平的增加并非一直对健康有利。实际上，增加的脂联素水平已被发现存在于有糖尿病相关微脉管并发症［8］以及心血管猝死的高风险人群中［9－10］，因此，此类问题还有待深入研究。

3．2 运动对血清脂联素和脂肪组织脂联素mRNA表达的影响 由于脂联素与IR之间存在相互关系，而规律运动可改善IR;因此，推测运动是否通过脂联素起作用。运动对循环脂联素水平影响的研究以人体实验居多。正常机体的急性运动和部分慢性运动实验结果多数倾向于无影响，如 M．A．Ferguson 等［11］、R．R．Kraemer 等［12］、M．W．Hulver 等［13］、C．Punyadeera等［14］的研究。在本实验中，E组与C组相比，未观察到运动对普食大鼠血清脂联素的影响。推测脂联素水平变化是运动改善胰岛素敏感性的联结环节，肥胖和糖尿病患者等人群对运动刺激敏感性较强，以他们为实验对象可能会观察到脂联素水平的变化;然而，对IR受试者(超重和/或糖尿病)的研究结果是矛盾的。如 A．D．Kriketos等［15］、Fatouros等分别研究运动对超重中老年男性的影响，发现血清脂联素升高。H．Yokoyama等［16］、P．Boudou 等［17］的 研 究 结 果 与H．K．Brekke等［18］和 T．J．Marcell等［19］实验结果一致，均未发现运动对T2DM患者血浆脂联素的影响。G．P．Nassis等［20］对希腊21 名年龄在 9 ～15 岁的肥胖或超重女孩进行了长达12周的有氧训练，结果有助于改善肥胖儿童的IR，但血清脂联素、白细胞介素－6(IL－6)未改变。在本实验中，HE组与H组相比，也未观察到运动对高脂IR大鼠血清脂联素的影响。

有研究表明，亚极量运动并不能改变脂联素浓度，提示运动改善胰岛素敏感性可通过不同的机制。亦有学者假设运动是通过改变脂联素的作用行为发挥抗炎作用，从而有助于减轻肥胖个体的IR［21］。也有研究认为，脂联素的改变是运动训练参与调节胰岛素敏感性的结果，而不是原因。T．Yatagai等［22］认为，运动介导胰岛素作用增强表现为不依赖于血浆脂联素的变化。进一步的研究结果显示，无体重或体脂减少的慢性运动对IR人群血浆脂联素水平不产生影响，体重或体脂减少会伴随脂联素水平显著增加，即只有运动干预伴有体重或体脂减少时，运动才有可能间接增加血浆脂联素浓度。值得注意的是，体重或体脂减轻的水平可能是血浆脂联素水平变化的重要决定因素。例如A．S．Ryan等［23］对超重和肥胖绝经期妇女实施为期 6个月的减重计划(有氧运动或力量训练)，体脂减少3%，而对血浆脂联素水平没有影响。在另一项实验中，采用的运动方案使体重减轻较前者显著，结果却增加了血浆脂联素水平和胰岛素敏感性［24］。

长期运动训练对内脏脂肪组织脂联素基因表达影响的研究鲜见。唐兆生等［7］通过建立IR动物模型加运动干预，表明长期运动训练提高了内脏脂肪组织脂联素基因表达。在本实验中，HE组与H组相比，运动干预未显著影响内脏脂肪组织脂联素mRNA表达。与上文提及的运动影响血清脂联素水平相似，只有降低趋势。实际上，类似结果也有很多报道［25－28］。根据以往对瘦素的研究［29］，瘦素在运动后有延迟性下降;我们推测脂联素也可能在运动后出现延迟性变化。提示今后研究运动与脂联素水平变化关系，可增加观测点。也有学者发现，虽然脂联素浓度未发生变化，但在成年人中IL－6水平在长期体育锻炼中显著下降，因而IL－6与脂联素的比值发生了变化，他们因此提出可能是此比值的改变改善了IR［21］。可见，就较单纯研究运动与某个脂肪细胞因子关系而言，研究运动状态下多种脂肪细胞因子间的相互关系，将是今后研究运动作用机制所要关注的。

3．3 AMPK介导骨骼肌对持续规律运动产生适应在运动与骨骼肌适应研究中，学者们提出“运动因子”或“肌因子”的概念［30－31］。国外学者提出当AMPK被纳入其中，并指出与其他“运动因子”内分泌水平发挥作用不同，AMPK是从细胞水平参与调节的。研究表明，AMPK持续激活引起骨骼肌改变，其效果与运动训练引起的适应一致［32］。K．S．Rockl等［33］通过对野生型和转基因鼠的对比研究发现，AMPK在介导骨骼肌纤维由Ⅱb型向Ⅱa型转变以及增加己糖激酶Ⅱ蛋白活性中是必要的，证实AMPK介导了骨骼肌对运动训练的适应。AMPK可作用于许多转录因子以调节基因表达，这也是机体对持续规律运动产生适应的原因。如:激活细胞核呼吸因子－1/2(NRF－1/2)，上调呼吸链蛋白的表达;激活过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)α，上调脂肪酸β氧化过程中的酶;激活线粒体转录因子A(mtTFA)刺激线粒体基因组的表达。E．O．Ojuka等［34］也证明了 AICAR刺激后的骨骼肌中mtTFA、PGC1α的表达和NRF－1/2与DNA的结合均增加。近来一项采用生物芯片技术的研究发现，骨骼肌中总计有234个基因上调和130个基因下调AMPK。在本实验中，有氧运动未显著影响普食大鼠股四头肌AMPKα蛋白表达，而显著升高其磷酸化水平，E组较C组高83．7%。提示大鼠骨骼肌对耐力运动产生很好的适应，可能是通过连续激活骨骼肌AMPKα的活性引起。

3．4 运动对高脂大鼠IR形成中骨骼肌AMPKα蛋白表达及磷酸化水平的影响 通过对大鼠研究表明，运动中骨骼肌脂肪酸氧化的增多与抑制ACC活化而使之磷酸化有关，其次也与丙二酰辅酶A(MCA)浓度降低有关。D．Davis在人体研究亦表明，进行强度分别为60%、85%、100%V·O2max的单腿伸膝运动时，采用肌肉活检测定ACC，发现ACC活性下降50%～70%，且随运动强度增加而下降更明显。这些研究揭示，运动可削弱骨骼肌ACC活性，导致MCA浓度下降，消除对肉碱－软脂酰辅酶A脂酰转位酶－1(CPT－1)的抑制，增加脂肪酸的氧化。AMPK改善IR机制之一即是通过抑制ACC活性，导致MCA浓度下降，消除对CPT－1的抑制，增加脂肪酸的氧化而实现的;因此，假设:AMPK激活是运动改善大鼠骨骼肌IR效应发挥的机制之一。在本实验中，运动未显著影响高脂大鼠骨骼肌AMPKα蛋白表达，而显著升高其磷酸化水平，HE组较H组高43．2%。验证了以上假设，提示运动延缓高脂大鼠IR的形成可能通过连续激活骨骼肌AMPKα的活性引起。这与 A．Sriwijitkamol等［35－36］研究结果一致。其作用可能主要通过调节以下几种酶的作用实现:1)ACC，它包括ACCα和ACCß2种形式，前者主要存在于肝和脂肪组织，而后者主要存在于骨骼肌和心肌细胞;2)MCA脱羧酶(MCD)［37］;3)激素敏感性脂肪酶(HSL)［38］。

3．5 大鼠肝脏AMPK的激活及运动对其的影响ACC是我们熟知的AMPK的一个下游靶因子，与骨骼肌相似。肝脏AMPK被激活后在转录和转录后翻译水平使ACC失活，降低MCA的合成，通过增强CPT－1活性而提高脂肪酸ß氧化，同时也抑制胆固醇合成关键限速酶戊二酰辅酶A还原酶(HMG CoA reductase)［39－41］。糖异生的2个关键限速酶磷酸烯醇式丙酮酸羧基酶(PEPCK)和6－磷酸葡萄糖酶(G6Pase)在调节空腹血糖水平中起重要作用［42－43］。研究表明，在 HepG2细胞和原代大鼠肝细胞中，AICAR抑制PEPCK转录，证明AMPK激活在抑制肝糖异生中的重要地位［42－43］。当给大鼠肝脏在体注射AICAR时，发现肝糖输出被抑制［44］，因此，肝脏AMPK的激活通过提高脂肪酸ß氧化、抑制胆固醇合成、抑制肝糖异生和肝糖输出，促进了外周摄取葡萄糖、胰岛素敏感性增强，进而维持机体能量稳态等重要生理效应的实现。骨骼肌在运动中得到很好的适应，同样，肝脏也是运动时重要的能量来源。

已有大量研究关注运动中骨骼肌AMPK的激活，但对于肝脏AMPK激活的研究相对较少。M．Hoene等［45］研究发现，小鼠在一次急性运动后同时激活了肝脏和骨骼肌AMPKThr172磷酸化表达，表明肝脏在急性运动后产生了快速而深刻的适应。R．S．Rector等［46］研究大鼠在12周的慢性运动后，肝脂肪变性减轻，部分是由肝脂肪酸氧化增强和促进脂肪酸合成的关键蛋白的表达降低所介导。K．Takekoshi等［47］研究发现，中等强度的长期运动(60%V·O2max，12周)能显著增加大鼠肝脏中AMPK/ACC磷酸化活性，同时增加了AMPKα1和α2亚基的mRNA及蛋白表达水平。表明AMPK介导了肝脏对长期运动的适应。在本实验中，有氧运动未显著影响普食大鼠肝脏AMPKα的蛋白表达和活性，可能是因为本研究中普食大鼠肝脏对规律运动的应激敏感性没有高脂大鼠肝脏高，运动更易对高脂大鼠的肝脏产生较为深刻的影响。高脂大鼠肝脏AMPKα蛋白表达未发生显著变化，而其活性显著升高了，HE组较H组高51．1%。提示运动延缓高脂大鼠IR的形成可能通过连续激活肝脏AMPKα的活性引起。

3．6 AMPK介导脂联素和运动改善IR的特殊地位脂联素通过ACC增强脂肪酸氧化，同时在骨骼肌和肝脏中均提高胰岛素敏感性［48］。脂联素是AMPK的一个理想激活剂。球型或全长型脂联素以剂量依赖的方式增加小鼠比目鱼肌中AMPK磷酸化。与骨骼肌不同的是，只有全长型脂联素(与肝脏细胞膜有较高亲和力)可刺激肝脏AMPK磷酸化，还可降低肝脏糖异生关键酶 PEPCK和G6P的表达水平［48］;因而，肝脏AMPK的激活还是脂联素介导降低肝糖异生和触发体内葡萄糖水平降低所必需的。学者们研究了肝脏和骨骼肌脂联素信号传导中 AMPK的地位。M．J．Yoon等［49］在体外培养的肌细胞中发现，脂联素增强脂肪酸的氧化是顺序激活 AMPK、p38MAPK、PPARα通路。以上研究说明AMPK是脂联素在肝脏和骨骼肌发挥胰岛素敏感效应所必需的。

运动提高肌胰岛素敏感性的机制至今仍不十分清楚。过去认为肌收缩和身体运动可以强有力地增加骨骼肌葡萄糖摄取，近似于胰岛素的作用效应［50－51］。有研究表明，运动后糖原合成的慢速阶段与肌胰岛素敏感度增加有关，但其机制并不牵涉胰岛素受体结合位点或受体活性的增加［52－53］。在血糖胰岛素钳夹条件下发现，运动后肌胰岛素受体酪氨酸活化酶活性，IRS－1，PI3－K，蛋白激酶 B、肝糖合成酶激酶3 等与未运动肌相比无变化［54］。这些结果提示运动后肌胰岛素敏感度的增加与胰岛素信号转导并无关系，但不能排除运动通过改变胰岛素信号转导过程中某些复合物的空间结构，或是影响一些还未被确认的中间物以增强肌胰岛素敏感性这一可能性。研究表明，AMPK是介导运动提高胰岛素敏感性的候选分子机制。

目前运动激活AMPK进而改善IR的研究和发表最充分的文献，集中体现在AMPK介导运动增加葡萄糖摄取能力。运动激活AMPK通过调节脂代谢改善胰岛素敏感性的作用机制有其独特之处。表现为AMPK与PPARγ在调节脂代谢作用机制上的不同。PPARγ是一个具有合成代谢的调节者，它促使脂肪合成，导致脂肪组织TG积聚从而降低血TG水平，但是此过程导致体重的增加;而AMPK是分解代谢的调节者，通过ACC抑制脂肪酸合成和增强其ß氧化而降低TG水平。研究表明，ACCß基因缺陷小鼠尽管摄入高能量饮食，但其脂肪贮量仍低于野生型小鼠，表明AMPK激活没有导致体重增加。另外，AMPK激活磷酸化HSL，从而促进脂肪组织内过量的脂质代谢。可见，控制脂代谢异常，AMPK激活优于激活PPARγ。要想确立AMPK激活在运动中的作用、地位很困难。原因之一可能是运动时还存在诸如 MAPK、PKCs、CaMKs、Ca2+等其他更多的信号途径被激活，会与AMPK作用相重叠。另一原因是缺乏有效和明确的药理学工具抑制不同骨骼肌的 AMPK信号。总之，AMPK是运动时能量代谢的重要调节因子，可通过不依赖于胰岛素作用的机制而增加骨骼肌葡萄糖转运及脂肪酸氧化，这对IR、T2DM及MS患者十分有利。对其作用机制的深入研究，将为更好地理解运动干预防治营养过剩性慢性病及药物研发提供依据。在本实验中，运动可能通过激活肝脏AMPKα的活性，促进肝脏的脂质氧化，降低脂质的异位沉积，阻止或延缓了大鼠IR的形成。AMPK可能是运动防治脂毒性的关键靶点。

4 结论

内脏脂肪组织脂联素mRNA表达的下调可能参与了高脂大鼠IR的形成。未观察到运动对大鼠血清脂联素水平、内脏脂肪组织脂联素mRNA表达有显著影响，提示运动发挥增敏效应、延缓IR形成与脂联素是否在运动条件下发生变化的因果关系尚不能定论。

运动提高了大鼠骨骼肌和肝脏AMPKα(Thr172)磷酸化水平，提示骨骼肌和肝脏AMPKα(Thr172)活性的连续激活可能是运动延缓高脂大鼠IR形成的关键机制之一。

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