桑椹原花青素提取的响应曲面优化分析

袁 玲，李建华

(湖北工程学院 特色果蔬质量安全控制湖北省重点实验室,湖北 孝感 432000)

桑椹原花青素提取的响应曲面优化分析

袁 玲，李建华

(湖北工程学院 特色果蔬质量安全控制湖北省重点实验室,湖北 孝感 432000)

以桑椹原花青素的提取率为指标，利用中心组合设计(central composite design,CCD)优化桑椹原花青素超声提取工艺。结果表明，建立的三次多项式数学模型是合适模型，优化提取工艺参数为：超声功率315W，液料比60:1(mL/g)，提取时间12min。在该条件下桑椹原花青素的最优提取值是496.29 μg/g。经验证，所得工艺参数准确，可指导桑椹原花青素的提取生产。

桑椹；原花青素；响应曲面分析；超声波；提取工艺

桑椹(Mulberry)为多年生木本植物桑(MorusalbaL.)的成熟浆果。桑椹不仅营养价值高，而且还含有矿物质、氨基酸、维生素、黄酮、多酚等多种丰富的药用成分，具有抗肿瘤、抗病毒、治疗心脑血管疾病等作用[1]，被卫生部认定为“既是药品，又是食品”的资源。桑椹的药用成分及生物学活性越来越引起国内外学者的兴趣。

原花青素(Procyanidins，PC)是一类聚多酚化合物的总称，人体内不能合成，是一种良好的氧自由基清除剂和脂质过氧化抑制剂，是迄今人类发现的最强、最有效的自由基清除剂之一[2]。具有抗氧化、抗生物突变等活性[3]，有很好的保健效果[4]。原花青素易溶于温度50℃以上热水及浓度为30%的乙醇[5]。已有少量以桑椹或桑椹果酒酒糟为原料，有机溶剂提取桑椹原花青素的工艺研究报道[6-7]。本文采用超声水提法，对桑椹中的原花青素提取工艺进行优化，为桑椹原花青素的开发利用提供参考依据。

1 材料和方法

1.1材料与试剂

试验用桑椹采自湖北省孝感市朋兴乡，45℃烘干，粉碎过50目筛备用。原花青素标准品(中国药品生物制品检定所)。所用试剂正丁醇、硫酸铁铵、浓盐酸、甲醇、无水乙醇均为分析纯。

1.2仪器与设备

Cary 60紫外可见分光光度计(安捷伦科技(中国)有限公司)；DL-480B智能超声波清洁器(上海之信仪器有限公司)；SHZ-III循环水真空泵(上海亚荣生化仪器厂)；PL203电子天平(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司)； HH-4数显恒温水浴锅(江苏金坛市荣华仪器制造有限公司)。

1.3方法

1.3.1 确定检测波长

准确配制质量浓度为0.50mg/mL的原花青素标准溶液，吸取0.3mL于10mL具塞比色管中，加入甲醇溶液至1.0mL，然后加入6.0mL正丁醇-盐酸溶液(体积比为95∶5)和0.2mL质量分数为2%的硫酸铁铵溶液(临用时配制)，摇匀后，置沸水浴中加热40min，然后迅速冷却[8]，在波长400～700nm处进行扫描，确定其最大吸收波长。

1.3.2 标准曲线的绘制

吸取质量浓度为0.50mg/mL的原花青素标准溶液0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5 mL置于6支10mL具塞比色管中，各加入甲醇溶液至1.0mL，分别配成0，50，100，150，200，250mg/mL标准品溶液，在上述优化的条件下，测定其吸光值并绘制标准曲线。

1.3.3 试验设计

使用Design-Expert软件中的中心组合设计(Central Composite Design ，CCD)模块中的二次回归正交旋转组合设计，设计了一组3因素5水平的共计20次的实验(full CCD 设计)，其中析因部分实验次数为14次，星点数为5，保证均一精密性的中心点重复次数手动调整为6，本试验设计的因素及水平见表1。

表1 中心组合设计因素水平表

1.3.4 桑椹原花青素的提取与测定

准确称取1.00 g干粉末，按照中心组合设计试验中设置的不同提取条件，分别进行浸提、离心、抽滤，收集各个提取条件下得到的提取液以备用。各提取液按1.3.1中方法处理后，测定吸光值，计算样品中原花青素的含量。

1.3.5 验证与提取次数确定

在最优条件下提取桑椹原花青素并与预测结果进行比较(设置4个重复)，以确定优化模型预测的准确性；将第一次提取过滤所得的桑椹残渣按同样的条件再提取一次，以确定所需提取次数。

1.3.6 数据处理

用Cary 60紫外可见分光光度计分析系统自带软件绘制波长检定曲线，用Excel软件拟合标准曲线，用Design Expert 8.0软件进行多元回归及方差分析[9]。

2 结果与分析

2.1原花青素检测波长的确定

将处理好的原花青素标准溶液倒入直径为1cm的石英比色皿中，在Cary 60紫外可见分光光度计中从400nm到700nm进行扫描，扫描结果如图1所示。

图1 原花青素波峰检测

从图1可以看出，原花青素在可见光区有一明显的吸收峰，波峰所在波长为550nm，因此铁盐催化比色法测定原花青素含量的检测波长为550nm。

2.2标准曲线

图2 原花青素标准曲线

以原花青素标准溶液浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，得到原花青素标准曲线，如图2所示。 Excel软件计算得到回归方程为y=0.0022x-0.0076，决定系数R2=0.9974，表明该回归方程比较可靠。

2.3试验结果

以超声波功率、料液比、提取时间三个因素为自变量，20次试验得到桑椹原花青素提取量(R)如表2所示。

2.4模型的建立与方差分析

利用Design-Expert软件对试验结果(表2)进行回归及方差分析[10](分析结果见表3)，发现本研究符合三次方模型，经过响应曲面法的拟合计算得出该模型的决定系数R-Squared为0.9506，表明该模型具有较高的可信度；校正系数RAdj=0.8826 ，表明在原花青素含量总的变异中，有88.26%是由独立变量引起的。失拟项不显著，表明该模型能够对桑椹原花青素的提取进行预测和分析。

表2 响应曲面分析试验设计方案及结果

以超声波功率、料液比、提取时间三个因素作为自变量，分别以A、B、C表示，原花青素提取量(R)为因变量， 即响应值，得优化的回归方程为：R=541.27-1.97A-1.46B-7.06C+0.03AB+0.06AC+0.34BC+2.10A2-0.03B2-0.55C2-1.45ABC+0.01C3。R的物理意义是每克干桑椹提取原花青素的微克数。方程中各项系数绝对值的大小直接反应了各因素对响应值的影响程度。系数的正负反应了影响的方向。由回归方程可知，料液比的线性项及功率、料液比的二次项对原花青素的提取率影响显著。

表3 三次多项式模型方差分析表

2.5参数优化、验证与提取次数

在Design Expert 8.0软件的优化(optimization)模块中，将优化标准设置为最大值800，求解得R的最优值是496.29μg/g，预测的最佳实验条件为：超声功率315W，液料比60:1(mL/g)，提取时间12min。为检验优化条件的准确性，按照上述优化得到的工艺参数，重复进行4次试验，得其平均值为505.52μg/g，与预测值相差1.86%，表明实验值与预测值基本吻合。

在最优提取条件下连续提取2次，发现桑椹原花青素第一次提取率可达84.6%，表明在此工艺条件下，桑椹原花青素的一次提取成功率较高。

3 结论

本研究以桑椹原花青素提取量为响应值，通过多元拟合方程，获得了桑椹原花青素提取工艺中各影响因子的最佳提取参数。以水为溶剂，在超声波功率为315W，液料比60:1，提取12min的工艺条件下，可从1g 烘干桑椹中提取原花青素496.29μg。验证实验表明，本文设计的工艺条件稳定，实验值与预测值相差1.86%，基本吻合；在此工艺条件下，桑椹原花青素的一次提取率较高。而且，本工艺条件无污染、操作简便，提取率高，在桑椹原花青素提取实践中具有较高的参考价值。

[1] 吴祖芳,翁佩芳.桑椹的营养组分与功能性分析[J].中国食品学报,2005,5(3):102-107.

[2] 赵平,任鹏,张月萍.原花青素抗氧化活性测定方法比较[J].现代化工, 2012,32(5): 119-122.

[3] 张丰源.原花青素抗肿瘤作用及机制研究进展[J].重庆医学, 2012,41(27): 2887-2888.

[4] 高羽,董志.原花青素的药理学研究现状[J].中国中药杂志,2009,34(6):651-655.

[5] 彭清忠,谢德玉.原花青素聚合作用机理研究进展[J].西北植物学报,2012,32(3):624-632.

[6] 包立军.桑椹中原花青素超声波提取工艺研究[J].安康学院学报, 2012,24(6):81-84.

[7] 左勇,李杨,谢晖,等.桑椹果酒酒糟中原花青素提取工艺研究[J]. 中国酿造,2012,31(8):40-44.

[8] 娄彬,张楠,游江舟,等.响应面法优化石榴皮中原花青素提取工艺[J].湖北农业科学,2012,51(17):3816-3820.

[9] 徐向宏,何明珠.试验设计与Design Expert、SPSS应用[M].北京:科学出版社,2010：154-168.

[10] 邓曦,王厚民,田娟,等.响应曲面法优化鲜桑椹中原花青素的提取工艺[J].湖北农业科学,2012,51(9):1847-1850.

(责任编辑：张凯兵)

OptimizationofExtractionProcessofProcyanidinfromMulberrybyResponseSurfaceMethodology

Yuan Ling，Li Jianhua

(HubeiKeyLaboratoryofQualityControlofCharacteristicFruitsandVegetables,HubeiEngineeringUniversity,Xiaogan,Hubei432000,China)

Using extraction rate as an indicator, the central composite design model was used to design an ultrasonic extraction technology of procyanidins from mulberry. Result showed that the cubic mathematical model was the optimal one and the optimum extraction parameters were as the following：ultrasonic power 315 W, liquid solid ration 60:1 (mL/g), extraction time 12 min, and the predicted extraction rate of procyanidins was 496.29 μg/g on the same conditions. It was verified that the processing parameters in this experiment were accurate and could be applied in the mass extraction of procyanidins from mulberry.

mulberry; procyanidins; response surface analysis; ultrasonic wave; extraction technology

TS202.3

A

2095-4824(2013)06-0060-04

2013-08-30

生物质废弃物转化利用湖北省协同创新中心(SWZ010)

袁 玲(1970- )，女，湖北孝感人，湖北工程学院生命科学技术学院副教授。

李建华(1969- )，男，湖北孝感人，湖北工程学院生命科学技术学院教授，理学博士。